Primer Extension Assay #

Primer Extension Assay는 DNA 또는 RNA의 5' 말단의 sequence를 확인하기 위한 실험방법이다. DNA를 이용할 때에는 single strand로 만들어주는 단계가 필요하다. 5'말단 근처에 상보적인 동위원소로 표지 된 primer를 이용하며 역전사효소를 이용하여 extension 한다. Primer extension을 위한 marker는 template에 ddATP, ddGTP, ddCTP, ddTTP를 mild하게 써서 각각 염기서열단편들을 만들고 이를 sequencing gel에 loading한 후 사용한다.

실험방법 #

1. primer 5'에 [r-32P] 동위원소를 이용하여 labeling 한다.
2. labeled primer는 template과 함께 각각 ddATP, ddGTP, ddCTP, ddTTP 그리고 역전사효소가 섞인 4개의 sample을 준비한 후 PCR을 이용하여 extension한다.
3. Extension된 sample은 각각 gel에 loading하기 전 purifying 과정을 거친다.
4. Purified sample을 gel에 loading 하기전 sequencing marker를 준비한다.
5. Purified sample과 marker를 sequencing gel에 loading을 한다.
6. Denaturated sample을 분석한다.

그림. Primer extension의 실험방법 (출처:wikipedia)

Assay의 이용 #

일반적으로는 mRNA의 전사 시작 부위를 결정하는데 주로 사용이 되나 다른 연구에도 많이 이용이 가능하다. 예를 들면 HBV의 경우 바이러스 복제 과정에서 만들어지는 중간 DNA 산물체들이 나오는데 이를 검출하는데도 이용을 할 수 있다. 또한 gap이 있는 부위의 sequencing을 하는데 이용을 하기도 한다.
그림. HBV 연구에서의 Primer extension assay의 이용 (출처:J. Virol. January 2014 vol. 88 no. 1 154-163)

실험 시 주의점 #

• marker를 제작할 땐 각 step의 시간을 잘 맞춰야 한다. 잘 맞추지 않을 시 다양한 길이의 단편이 나오지 않을 수 있다.
• PCR 할 시 internal standard를 넣어서 PCR의 variation을 최소화 할 수 있다. internal standard는 분석 시 정량 할때 사용될 수 있다.

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