prediction of microRNA in malignant B cells
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Deep sequencing of the small RNA Transcriptome of normal and malignant human B cells identifies hundreds of novel microRNAs #
Blood. 2010 Dec 2;116(23):e118-27
연구목적 #
31개의 정상 또는 악성 B세포 종양 샘플로부터 deep sequencing을 통해 small RNA transcriptome을 분석한다.
연구배경 #
① (2010년 당시) 700개 정도의 human microRNA가 발굴되었다.
② microRNA을 발굴하기 위한 방법으로는 cloning 과 Sanger sequencing을 사용하여 속도가 더디었다.
③ Deep sequencing을 통해 small RNA를 대량 발굴할 필요가 있다.
연구대상 #
연구 방법 #
① Total RNA (5ug) prep and gel running
② ~17-25nt RNA were excised from the gel
③ Ligation to sequencing adaptor on both ends and RT
④ PCR amplification for 15 cycles
⑤ Illumina Deep sequencing (GSE22898)
연구 결과 #
Deep sequencing identifies the small RNA Transcriptome of normal and malignant B cells
① Adaptor trimming
② Removal of low-quality Read
③ Representative Reads
④ Genome mapping (100% match)
⑤ UCSC RNA에서 5bp 이상 겹치는 read는 제거
⑥ 이미 알려진 microRNA와 novel microRNA를 분류
⑦ RNAfold를 이용하여 이차 구조 예측
⑧ miRDeep을 이용하여 miRNA precursor processing 등을 예측
⑨360개의 known microRNA의 발현을 RT-PCR로 검증한 경우 72%의 sensitivity와 84%의 specificity로 검증
⑩ 총 619개의 microRNA가 도출되었는데 그 중 333개의 miRNA는 known microRNA이고 나머지 286개는 novel microRNA로 추정
⑪ microRNA외에도 tRNA, rRNA, snoRNA, snRNA, piRNA등의 발현도 관측 (Fig. 2a)
Deep sequencing reproducibly measure miRNA expression in biologic replicates
① biological replicate간의 유사성이 p<10^-6으로 높은 유사성을 보였다. (Figure 2B)
② RT-PCR 결과와도p<10^-6으로 높은 유사성을 보였다. (Figure 2C)
Hundreds of known and novel miRNAs are expressed in normal and malignant B cells
① 2/3가량의 miRNA는 known miRNA이며 나머지는 novel miRNA임 (Figure 3A)
② 대부분의 novel miRNA는 발현이 known miRNA에 비해 낮았다.
③ 상당 부분의 known, novel miRNA가 서로 다른 B cell lineage에서 공통적으로 발견되었다. (Figure 3B, C)
④ 대부분의 (96%) novel miRNA는 1개 이상의 sample에서 발견되었으며 소수의 miRNA만이 특정 cell에 배타적으로 존재하였다. (Figure 3D)
⑤ 4종류의 GSE 데이터에서 71%의 novel miRNA가 발견되었다.
⑥ 4종류의 mammal (chimpanzee, rhesus macaque, mouse, dog)을 대상으로 novel miRNA 존재 여부를 분석한 결과 80%이상의 miRNA가 2종 이상에서 발견되었다. (Figure 3F)
⑦ 75%의 novel, 80%의 known miRNA에서 100개 이상의 target 유전자가 예측되었다.
Real-time PCR independently confirms the expression of 92% of the novel miRNAs
① novel miRNA 중 DLBCL샘플에서 발현이 있는 86개의 candidate에 대해서 RT-PCR를 수행한 결과 92%에서 발현이 검증되었다. (Figure 3G)
miRNAs are efficacious in the distinction of clinically relevant groups of lymphoma
① 서로 다른 DLBCL case에서 특이적으로 발현되는 miRNA가 관측되었다. (Figure 3H)
② 25개의 predictor miRNA 중 6개의 miRNA가 novel miRNA 이었다.
③ chromosome 9, 14번에서 novel miRNA cluster를 발견하였으며 primate에서만 발견되는 6개의 miRNA를 cluster화하고 있다. (Figure 4A)
④ Drosha를 knock-down한 경우에 primary miRNA의 발현이 증가하는 것을 발견하였다. (Figure 4B)
⑤ 해당 Cluster의 miRNA는 germinal center에 주로 위치하는 것으로 관측되었다. (Figure 4C)
⑥ 해당 cluster의 miRNA는 TGFbeta의 SMAD2, SMAD3를 target하는 것으로 예측되었으며 TGFbeta pathway에 해당하는 유전자들의 발현 변화가 GSEA 분석에서 발견되었다. (Figure 4D)
