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mbd-seq #
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Category
Biology

mbd-seq #

개요 #

mbd-seq (methyl-CpG-binding domain sequencing)은 DNA Methylation Method 중 하나이며, Targeted, Whole genome, Captured sequencing 방법 중 Targeted sequencing으로 이용되는 방법이다. 이 방법은 메틸화된 CpG에 결합하는 methyl-CpG-binding donmain (MBD) 단백질을 이용하여 선택적으로 methyl-CpG만을 캡쳐하여 sequencing하는 기법이다.

DNA methylation? #

먼저 이 방법에 대해 설명하기 전에 DNA methylation에 대해서 간단하게 알아보겠다. 간단히 말해 메틸 그룹이 DNA 분자에 첨가되는 과정을 DNA metylation이라 한다. DNA 메틸레이션은 CpG islands (보통 1,000-2,000bp의 길이이며, GC contents가 높은 지역)에서 일어나며 DNA methylatransferage라는 효소가 촉매를 한다. 즉, CpG 염기서열 중 시토신 (cytosine) 염기가 메틸기에 의한 화학공유결합으로 인한 변형을 말한다. CpG는 전사조절부 부위인 promotor 앞뒤로 수백 뉴클레오티드 안쪽에 위치를 하며 보통 eukaryotic genes의 전사침묵과 직접접으로 연관을 하는데, 이러한 유전자는 tissue-specific gene이다. 따라서 CpG 서열이 메틸화되는 정도가 강할수록 promotor에서의 전사억제 정도가 증가하는 특성을 보인다. 사람의 경우 유전체의 1~2%가 CpG islands이며, CpG 위치의 80~90%가 메틸화되어 있다고 한다. 메틸화된 패턴의 변화 및 관련 유전자의 활동은 사람의 종양에서 종종 발견된다는 것이 널리 알려져있다.

  • CpG: 시토신과 구아닌 (guanine) 염기가 phosphate에 의해 분리된 서열을 의미하는 약어.

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<출처: www.naver.com>

DNA metylation analysis 기법 #

생체 내의 DNA methylation 양상을 분석하기 위한 방법으로 sodium bisulfite의 화합물을 이용하거나 메틸화 여부에 민감하게 반응하는 제한효소, 그리고 antybody를 이용하는 것이 있다.

분석 기법 중 가장 저렴한 방법은 sodium bisulfite (아황산수소나트륨)와 같은 화합물을 이용하는 것이다. 이 화합물은 메틸화되지 않은 시토신 (C) 에 작용하여 유라실 (U) 로 전환시킬 수 있다. 반면 메틸화된 시토신은 화합물에 영향을 받지 않아 반응 후에도 원래의 시토신으로 남게 된다. 즉, 아황산수소나트륨을 처리한 후 유라실로 전환된 시토신과 기존의 시토신을 확인하여 메틸화의 여부를 알 수 있다. 이를 위해 화합물 반응 후 DNA fragment를 PCR로 증폭하여 클로닝 벡터에 삽입하여 sequencing을 한다. PDR반응에서 U는 T로 변환되므로 반응 전의 DNA 염기서열과 비교하여 T로 바뀐 시토신은 메틸화되지 않은 것이며, C로 읽힌 것은 메틸화된 시토신이다.

최근에는 아황산수소나트륨과 같은 화합물을 이용하는 방법이 아닌 전장유전체 수준에서 분석을 하기 때문에, 앞서 말한 것과 같이 메틸화된 시토신을 특이적으로 인식하는 항체나 메틸화된 CpG에 binding하는 MBD-sequencing 방법이 있다.

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<출처: https://www.pngfly.com/png-8ke5vw/>

DNA metylation sequencing #

Image <출처: https://www.illumina.com/science/sequencing-method-explorer/kits-and-arrays/mbdcap-seq-methylcap-seq-mbd-seq-mbdcap-migs.html>

1) 먼저 Genomic DNA를 Sonitation 처리를 하고 DNA 절편을 형성한다.

2) 메틸화된 시토신에 결합할 수 있는 tagged-MBD portein을 incubation한다.

3) Protein-DNA complex는 portein tag에 특이적으로 결합하는 antibody와 함께 침전된다.

4) 침점된 DNA는 정체하여 DNA sample을 준비하고 seqeuncing한다.

5) Sequencing alignment methylation analysis

단점: 고품질 데이터를 얻기 위해 상대적으로 많은 Genome (ideally >1µg) 이 필요하다. 일반적으로 Biomaterials를 수집하는데 양이 한정되어있고 비용이 많이 든다.

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