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Xenopus Microinjection #

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Experiment

척추동물 양서류 모델인 Xenopus 또는 zebrafish와 같은 발달생물학을 연구하는 실험실에서는 Microinjection skill은 필수이다. 원하는 stage, 원하는 region, 원하는 농도를 정확하게 injection 해야하기 때문이다. 특히, Xenopus 모델 같은 경우에는 1ng, 100pg의 아주 낮은 농도에서도 injection을 해야하므로 쉽지는 않다. 그러나 한번 습득하면 여러가지 실험모델을 구상하여 다양한 실험을 할 수가 있다.

microinjection tip 준비 #

보통 실험실에서는 유리 모세혈관(glass capillary)를 이용한다. 그리고 PC-10 puller,
PN-30 puller 등의 기기로 유리 모세혈관을 분리한다. 이 기기는 온도로 time point를 설정하는데 보통 1 time, 2 time이 있다. 예를들어 1 time이란 50도의 온도로 시간 설정을 5초로 설정하면 5초 동안 한번에 유리 모세혈관을 분리하며, 2 time이란 50도의 온도에 시간 설정을 5초, 45도의 온도에 3초로 설정하면 처음 5초동안 모세혈관을 분리하다가 남은 3초 동안 최종적으로 분리한다. 즉, 2 time의 장점은 유리 모세혈관을 더 가늘게 만들 수 있다는 것이다. 마지막으로 글라인더를 이용하여 원하는 크기의 구멍으로 갈아준다. 끝이 가늘기 때문에 조심히 다뤄야 한다. 조금만 충격을 가해줘도 깨진다.

원하는 농도 설정하기 #

실험실마다 injector가 있을 것이다. 실험에 사용하기 전에 우리가 준비해둔 tip은 calibration을 진행해야 한다. 글라인더로 갈았기 때문에 육안으로 보이지 않는 glass의 잔재를 깨끗하게 하고, 1번의 injection 당 원하는 농도가 나오도록 준비해야 한다. 일반적으로 물 1ul를 빨아들이고, 전부 다 내뿜는 hit 수를 3번의 평균 값으로 정한다.

Embryo injectin 하기 #

각자 실험 조건에 맞게 관심이 있는 DNA 또는 RNA를 embryo에 주입한다. animal pole에서 dorsal은 등부분, ventral은 배부분이다. 주로 animal pole에 injection을 하여 phenotype을 빠르게 확인할 수 있는 장점이 있다. 만약 어떤 RNA를 주입하여 얼굴 턱뼈, 지느러미 등에 결함이 생겼다면 그 유전자는 dorsal 부분에 작용을 한다는 것을 알 수가 있다. 흔히 가장 잘 알려진 b-cateinin의 경우 ventral marginal zone에 4-cell stage에 주입하면 secondary axis structure의 phenotype을 볼 수가 있다.

주의할 점 #

보통 직접 만든 tip이기 때문에 잘 깨지거나 tip마다 용량이 다르다. 그러므로 항상 주의를 기울여야 하며 전체적으로 실험에 차질이 없도록 미리 3개 이상씩 준비해 준다. 평소에 아무 생각없이 있거나 마음이 다급해지면 깨질 확률이 높으므로 실험자는 평안한 마음과 집중력을 가질 수 있도록 해야 한다.

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