TaqMan technique #

1991년 Cetus Corporation에서 만들어낸 방식으로, 이후 Roche Molecular Diagnostics와 Applied Biosystems에서 기술을 개량하였다. Target에 상보적인 oligonucleotide의 양쪽에 각각 reporter molecule과 quencher molecule을 붙인 형태의 TaqMan probe는 Taq DNA ploymerase의 5’→3’ nuclease activity에 의해 가수분해되면서 방출되는 형광신호를 측정하는 방식이다.

TaqMan probe #

Quencher molecule #

TAMRA와 MGB라는 2종류가 있으며, MGB가 좀 더 specific하다. SNP genotyping의 경우는 MGB가 적합하다. probe의 3'에 위치한다.

1. TAMRA #

좋은 quencher로써 오랫동안 사용되었으나, 자체 발광하는 형광 분자이므로 background가 발생하며, 이 신호를 읽을 filter가 필요하다. 또한 적절한 Tm값을 맞추기 위해서는 probe의 길이가 30~40bp정도(혹은 그 이상)까지 길어지게 되어 specificity가 상대적으로 낮아지는 경향이 있다.

2. MGB #

2개의 subunit으로 구성된다. Probe의 3’에 붙은 NFQ(Non-Fluorescent Quencher)에 MGB(Minor Groove Binder)가 연결된 형태이다. NFQ는 형광이 아니므로 background가 발생하지 않는다. MGB는 Tm을 높여 probe의 길이를 13bp까지 짧아지게 할 수 있으며, clamp형태로 template와 probe의 결합을 좀 더 tight하게 하여 specificity가 상대적으로 높아지도록 한다.

Reporter molecule #

FAM, VIC, NED 등의 형광분자로 probe의 5’에 위치한다. Singleplex, gene expression assay에는 FAM을, endogenous control-VIC를, SNP assay와 같은 multiplex 실험에는 두 probe에 대해 각각 FAM과 VIC를 붙여 주로 사용한다. 사용하는 기기에 따라 형광분자를 다르게 사용한다.

TaqMan probe 제작 고려사항 #

1. 일반 primer의 Tm보다 약 10℃가량 높게 제작하며, allele-specific primer의 Tm은 동일하게 한다.
2. 약 15~30bp, 3’-end에 끝부분에 G,C가 2개 이상 넘지 않도록 한다. 되도록이면 G가 4개 이상 연이어 있는 sequence는 피한다.
3. Amplicon 사이즈는 50~150bp로 하며 최대 400bp를 넘지 않도록 한다.
4. %GC contents는 30~80%.

TaqMan SNP genotyping assay #

TaqMan technique을 이용하여 bi-allelic SNP를 구별하는 방법이다. Reporter molecule로 FAM과 VIC을, quencher molecule로 MGB를 사용한다. 100% matched sequence만이 Taq polymerase에 의해 분해되어 형광을 나타낸다. end-point detection 값을 측정하여 SNP type을 결정한다.