Sanger sequencing #

Sanger sequencing은 1977년에 Frederick Sanger에 의해 개발된 방법으로, 기본적으로 polymerase chain reaction (PCR) 과정에서 di-deoxynucleotide triphosphates (ddNTPs)에 의해 DNA strand가 합성되지 않는 chain termination의 원리와, 전기영동의 원리를 이용하여 염기서열을 확인하는 방법이다.

Sanger sequencing 원리 #

Sanger sequencing을 이해하기 위해서는 우선적으로 PCR 과정 대해 이해할 필요가 있다. DNA 서열 증폭을 위해서는 DNA를 구성하는 기본 단위인 deoxynucleotide triphosphate (dNTP)가 필요하다. DNA 서열에 dNTP가 중합될 때, DNA 서열 마지막 nucleotide 3번 탄소의 수산화기(-OH)와 새로운 dNTP 5번 탄소의 인산기가 반응하여 결합된다. Sanger sequencing 원리의 핵심은 ddNTPs에 있다. ddNTP는 dNTP의 3번 탄소에 산소(oxygen)이 존재하지 않는, 즉 수산화기(-OH) 대신 수소(-H)가 결합되어 있는 nucleotide 구조이다.

Fig1. ddNTP 구조

그림출처 : http://www.bio.davidson.edu/courses/molbio/molstudents/01licohen/sequencing.html

Sanger sequencing을 진행할 때는 dNTP에 추가적으로 소량의 ddNTP가 포함된 PCR을 우선 진행한다. 이 때, 4 가지의 ddNTP (핵산별로 ddATP (아데닌), ddGTP (구아닌), ddTTP (티민), ddCTP (사이토신))는 서로 다른 형광물질로 염색되어 있다. PCR 과정에서 DNA가 증폭되던 중 우연히 dNTP 대신 ddNTP가 결합된 경우, ddNTP의 3번 탄소에는 수산화기가 없으므로 더 이상 새로운 인산기가 결합될 수 없어 증폭이 중지된다 (chain termination). ddNTP의 결합은 무작위적으로 일어나게 되므로, 수 많은 증폭과정을 통해 거의 모든 염기서열 위치에서 chain termination이 일어나게 된다.

1차적으로 ddNTP를 포함한 PCR이 완료된 후에는, 염기서열을 크기에 따라 작은 순서대로 정렬할 수 있는 전기영동을 이용하여 증폭된 서열을 정렬한다. 크기순으로 정렬된 서열의 순서대로 형광 신호를 인식시키면, 염기서열 순서대로 해당 염기 서열에 해당하는 핵산 정보가 각 서열 끝에 마지막으로 결합된 ddNTP가 가지고 있던 형광물질 종류에 따라 읽히게 된다.

Fig2. Sanger sequencing 원리

sanger sequencing 단계 #

.1. DNA 템플릿 준비:

분석하려는 DNA 서열을 복제하고, 작은 조각들로 나누거나 PCR (Polymerase Chain Reaction) 등의 기술을 사용하여 증폭시킨다.

.2. 서열 반응 (Sequencing Reaction):

DNA를 복제하기 위해 필요한 다양한 구성 요소들(프라이머, DNA 폴리머레이스, DNA 빌더 등)을 함유하는 혼합물을 만들고, 혼합물에는 플루오로써마이드 (fluorescently labeled ddNTPs)와 비 플루오로써마이드 (dNTPs)가 함께 들어가게 되는데, 이 중 하나의 염기가 삽입될 때마다 DNA 합성이 중단되도록 한다.

.3. DNA 체인 종결 (DNA Chain Termination):

ddNTPs는 무작위로 DNA 체인에 삽입되면서 DNA 합성을 중단시키며, 이는 ddNTPs가 3'엔드에 연결될 수 없어서 발생한다.

.4. DNA 조각 분리:

반응 혼합물에서 생성된 DNA 조각들을 전기영동 또는 겔 전기영동을 사용하여 크기에 따라 분리하며, 이 과정에서 각각의 DNA 조각은 혼합된 ddNTPs에 의해 중단된 위치를 나타낸다.

.5. 반응의 결과 확인:

전기영동 된 겔을 빛을 측정하여, 어떤 크기의 DNA 조각이 어느 위치에 있는지를 확인하고, 플루오로써마이드를 사용하여 색깔을 부여하면, 서열을 결정할 수 있다.

.6. 서열 해독:

전기영동 패턴을 해독하여, 각각의 위치에서 삽입된 염기를 결정하고, 이를 통해 전체 DNA 서열을 얻을 수 있다.

sanger sequencing 특징 #

• Sanger sequencing은 상대적으로 정확하며, 길이가 500-1,000 염기 쌍 정도의 서열을 읽을 수 있다.
• 자동 염기서열 분석기를 사용하여 자동으로 데이터를 수집할 수 있다.
• 비교적 저렴하고 간단한 방법으로 DNA 서열을 결정하는 데 사용된다.

그림출처 : http://dwb.unl.edu/Teacher/NSF/C08/C08Links/www.piopio.school.nz/molmed.htm

Incoming Links #

Related Bioinformaticses (Bioinformatics 0) #

• ITS
• Sequencing
• prediction of microRNA in malignant B cells

Suggested Pages #

• 0.261 Metagenomics
• 0.142 NHLBI GO ESP
• 0.053 시퀀싱장비
• 0.049 전사체
• 0.048 Greengenes
• 0.045 Pseudomonas 연구 동향2
• 0.031 Metagenomic Software
• 0.025 피리미딘염기
• 0.024 퓨린염기
• 0.024 티민
• More suggestions...