SNP Genotyping #

SNP란? #

DNA 염기서열에서 1000개의 염기서열마다 하나의 염기서열(A,T,G,C)이 차이를 보이는 유전적 변화 또는 변이를 단일염기다형성(Single Nucleotide polymorphism, SNP)이라고 한다. 스닙이라고 읽으며, 이러한 SNP가 사람들의 유전적 다양성을 만들어 낸다. 즉 어떠한 DNA 염기서열에서 A(Adenine)를 가지고 있는 반면 어떤 사람은 C(Cytosine)을 가진다는 것이다. 그리고 이러한 미세한 변화로 인해 유전자의 기능이 달라지면서 phenotype을 변화 시켜 서로 다른 생김새 및 모양을 가진 사람이 되고, 질병에 대한 감수성 차이까지 만들어낸다. 인구집단에서 1%이상의 빈도로 변이가 발생한 염기서열 위치를 SNP라고 한다. 만약에 대립유전자형이 5%이상 빈도로 존재한다면 Common polymorphism이라고 하며, 1~5% 인 경우에는 rare polymorphism이다.

Genotype #

유전형 또는 유전자형이라고도 한다. 사람을 포함한 모든 생물이 모두 다른 생김새, 지문과 같은 개개인의 특징을 만들어내는 유전적인 구성 요소를 유전형이라고 한다.

Genotyping이란? #

유전체 서열상의 변이 Genotype을 알아내기 위한 실험 기법을 말한다.

SNP Genotyping? #

Genotyping을 진행하여 염기서열을 조사함으로써 각 개체의 염기서열 차이를 규명하는 것이다. 개인간에 존재하는 0.1%의 유전적 차이에 의해 서로 다른 모습과 같은 외형적 모습, 유전질병 등을 나타내게 되는데, 각 개인에서 나타나는 독특한 유전적 변이들을 밝혀내는 것을 SNP Genotyping이라 한다. 이러한 SNP genotyping을 함으로써 SNP가 맞춤의학, 즉 질병의 예방, 진단, 치료에 중요한 영향을 줄 수 있다.

*그림

SNP Genotyping의 원리 #

Genotyping이 발굴된 이후에 다양한 종류의 집단이나 시료에서 대량의 SNP genotyping이 요구되고 있는 실정이다. SNP genotyping의 원리에는 시료의 준비방법과 검색방법의 차이에 따라 4가지가 있다.

1. Allele-Specific Hybridization Allele-Specific Oligonucleotide hybridization(ASO)는 hybridization으로 염기서열 차이를 구별하는 방법이다. 2가지의 서로 다른 allel-specific probe가 정확하게 일치(perfect match)할 때만 상보적 표적 염기서열에 결합하도록 설계된다.(Hybridization) 이러한 Hybridization 방법은 대립유전자를 구별하는 곳에 효소가 포함되지 않는 가장 간단하면서도 흔하게 사용되는 genotyping 방법이다.

2. Primer Extension DNA polymerase는 primer의 3'-말단이 DNA 주형(template)과 상보적으로 정확히 일치할 때에 DNA 합성을 시작하여 PCR 산물이 생성되지만 불일치하는 경우에는 DNA합성이 일어나지 않는다. 따라서 PCR산물이 여부에 따라서 표적 DNA의 대립 유전자형을 추측해 볼 수 있다. 가장 일반적으로 형광물질이 표지된 ddNTP(dideoxynucleotide terminator)terminator를 이용하여 chain extension을 중단시켜 확인하는 방법을 사용한다.

3. Allele-Specific Oligonucleotide Ligation Ligation 방법은 각 대립 유전자 형에 특이적인 2개의 oligonucletide probe와 형광물질로 표지된 공통의 probe 1개 등 모두 3종류의 probe가 필요하다. 각 대립유전자형 특이 probe의 3'-말단부는 공통 probe의 5'-말단부에 바로 인접하도록 제작된다. 대립유전자 특이 probe와 template의 염기서열이 정확하게 상보적으로 일치하는 경우, 대립유전자형 특이 probe와 형광표지된 probe사이에 ligation 반응이 일어나고, 그렇지 않은 경우에는 ligation 반응이 일어나지 않는다. 따라서 Ligation 발생여부에 따라서 표적 DNA에 존재하는 대립유전자형을 추측할 수 있다.

4. Cleavage Invador Assay라고 하며, PCR 증폭 없이 Fluorescence Resonance Energy Transfer(FRET)을 이용하는 SNP 분석방법이다. 이 방법은 두가지 대립 유전자형에 대응하는 primary probe와 다형성 부위의 upstream 서열에 상보적으로 일치하는 Invador oligo등 세 가지 probe가 반응에 사용된다.

SNP Genotyping의 종류 #

Genotyping을 조사할 수 있는 방법은 굉장히 다양하며 각 방법은 고유한 분석 원리를 이용한다. 종류에는 Taq man, High Resolution Melting curve analysis(HRM), Pyrosequencing, FP, Invador, KASP genotyping, SNPplex SNapShot,Fluidigm , Affymetrix SNP Chip array, Massarray,GoldenGate assay, Infinium Assay, Molecular Inversion Probe, Multiplexed Genotyping 등이 있다.

SNP Genotyping의 응용 #

일반적으로 특정 유전자 형과 표현형 간의 연관성을 규명하기 위해서는 대량의 시료에서 genotyping을 수행한다. 대량의 시료를 genotyping한 넋은 많은 양의 시약과 비용이 소비된다. 대량의 시료에서 genotyping을 할 때 소요되는 비용과 작업량을 줄이기 위해 비교의 대상이 되는 그룹(case vs control)의 시료를 각각 하나의 시료 그룹으로 합(pooling) 하여 genotyping을 수행할 수 있다. 이를 DNA pooling genotyping 분석이라 한다. DNA pooling은 주로 질병 유전자 위치를 찾기 위한 대규모 연관성 연구의 비용을 줄이기 위한 방법의 하나로 사용될 수 있다.

Reference #

이종극/질병유전체분석법3(Genetic Variation and Disease)/

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