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Real-time PCR #
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Experiment

Real-time polymerase chain reaction; Real-time PCR (실시간 중합효소연쇄반응) #

실시간 중합효소연쇄반응 (Real-time polymerase chain reaction; Real-time PCR / quantitative real time polymerase chain reaction; qPCR)은 중합효소 연쇄 반응을 기반으로한 실험방법이고, PCR 증폭산물의 증가를 실시간으로 모니터링하여 해석하는 기술로써, End Point에서 PCR 증폭산물을 확인하는 기존의 PCR법에 비해서 다음과 같은 이점을 가지고 있다.

  • DNA와 RNA의 정확한 정량이 가능하다.
  • 전기영동이 필요 없어 신속하고 간편하게 해석할 수 있으며, 오염의 위험성이 적다.
  • 현재는 유전자 발현해석과 SNP typing 등에 있어 필수적인 기술이 되고 있다.

Real time PCR에 의한 정량분석의 원리 #

먼저 Real time PCR에 의한 정량 메커니즘을 살펴보면, Real time PCR에서는 PCR 증폭산물을 Real time으로 모니터링하여 증폭이 지수적으로 일어나는 영역에서 정량하기 때문에 기존 기술인 RT-PCR (Reverse transcription polymerase chain reaction)법과 달리 PCR의 증폭속도 이론을 기초로 정확한 정량이 가능하다. PCR에서는 1 cycle마다 DNA가 지수적으로 증폭하다가 안정기에 도달한다. 이 증폭의 모습을 Real time으로 모니터링한 그림이 증폭곡선이다. 아래의 모식도는 DNA 농도 (실제의 증폭산물량)를 청색으로 나타내고 그것을 형광으로 검출한 signal 강도를 적색으로 나타내었다. PCR 증폭산물량이 형광으로 검출 가능한 양에 도달하면 증폭곡선이 일어나기 시작해 지수적으로 signal이 상승하다가 안정기에 도달한다.

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초기 DNA량이 많을수록 증폭산물량이 검출 가능한 양에 달하도록 돌아가는 cycle 수가 적어지므로 증폭곡선이 빨리 나타난다. 따라서 단계적으로 희석한 표준시료를 사용하여 Real time PCR 반응을 하면 초기 DNA량이 많은 순서로 같은 간격으로 늘어선 증폭곡선이 얻어진다. 여기서 적당한 지점에 threshold를 설정하면 threshold와 증폭곡선이 교차하는 지점인 Ct값 (Threshold Cycle)이 산출된다. Ct값과 초기 template량 간에는 직선적인 관계가 있어 아래 그림과 같은 검량선을 만들 수 있고, 미지의 시료에 대해서도 표준시료와 마찬가지로 Ct값을 산출하여 이 검량선과 대조하면 초기 template량을 구할 수 있다.

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Real time PCR 장치 #

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검출 방법 #

Real time PCR에서는 PCR 증폭산물을 형광을 통해 검출을 하며, 검출 방법은 일반적으로 Interchelating 방법 (SYBR Green I)과 형광탐지 probe를 이용하는 방법이 있다.

Interchelating 방법 (CYBR Green I) #

Double strand DNA를 모두 검출하는 방법으로 유전자별로 probe를 준비할 필요가 없어 저렴한 비용으로 반응계를 구축할 수 있는 장점을 가지고 있지만, 검출 특이성은 그다지 높지가 않다. 과정으로는 decaturation 단계에 생성된 double strand DNA엣는 결합을 하지 않다가 primer가 annealing한 후, extension되면서 형성된 double strand DNA에 결합하여 형광을 발한다.

  • SYBR Green I는 double strand DNA에 결합하여 형광을 나타내는 시약 (interchelator)으로, PCR 반응으로 합성된 double strand DNA에 결합하여 형광을 발하며 이 형광감도를 검출하여 증폭산물의 생성량을 측정할 수 있다.
  • 단점으로는 double strand DNA를 모두 인식하기 때문에 비특이적 증폭에 의한 noise 신호도 다 수용한다는 것이고, 그렇기 때문에 반드시 melting curve를 분석해야 한다.

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Melting curve #

DNA나 RNA는 이중나선구조로 되어있고, 염기부분은 수소결합을 하고있다. 이 수소결합은 온도가 높아질수록 1개씩 분리가되며, 이를 핵산의 융해라고 한다. 핵산의 구성성분 중 염기는 자외선을 흡수하는데, 이중나선일 때보다 단일가닥일 때 흡수가 증가하게 되고, 따라서 어떠한 일정온도에서 급속히 자외선 흡수가 증가하고 일정값에 도달하게되면 보합상태가 된다. 이러한 관계는 melting curve와 관련이 있고, 중간 지점을 Tm (녹는점)이라 부른다. 형광 dye는 온도가 상승함에 따라 Tm에 가까워지면서 double strnad DNA가 변성이 되어 형광이 사라지게 되는데 이러한 신호의 변화를 그래프로 나타내어 확인할 수 있다. 만약, 비특이적 증폭에 의해 size가 다른 DNA가 증폭되었다면 온도에 따라 형광도가 감소하는 양상이 다르게 나타나기 때문에 비특이적 증폭여부를 판단하기 위해 melting curve 분석을 실시한다.

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형광탐지 probe를 이용하는 방법 #

비용은 많이 들지만 검출 특이성이 높아 비슷한 서열까지도 구별해서 검출할 수 있는 장점이 있다. 또한, DMA 크기에 상관업이 양을 측정할 수 있다.

TaqMan probe #

분석하고자 하는 유전자에 상보적으로 결합하는 ologo probe로 만들어져 있는데, 이 probe에는 형광을 띄는 reporter와 quencher가 붙어 있다. 그런데 quencher는 reporter와 가까이 존재하면 reporter가 형광을 띄지 못하도록 억제하는 역할을 하게 된다. 한편 새로운 primer가 DNA polymerase효소에 의해서 합성이 이루어지면 기존에 결합하고 있던 TaqMan probe는 DNA polymerase의 5'-exonuclease activity에 의하여 분해가 되고, 그렇게 되면 reporter가 quencher로부터 분리가 되어 형광을 발하게 된다. 이때 quencher에 의한 에너지 상쇄는 에너지가 고에너지 물질에서 저에너지 물질로 이동하는 FRET (fluorescent resonanc energy transfer) 원리가 적용된다. 그래서 PCR cycle이 계속될수록 형광의 강도는 높아지게 되고, 측정 가능한 수준에 도달한 때의 PCR cycle을 Ct값으로 표시하게 된다.

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Primer 설계 #

Real time PCR 실험의 첫번째 단계는 목적 유전자를 검출할 수 있는 primer(및 probe)의 선택이다. 전용 소프트웨어를 이용하여 직접 설계 할 수도 있고 설계가 끝난 것을 구입해서 사용할 수도 있다. Primer 설계는 Real time PCR를 성공시키기 위한 가장 중요한 요소로, PCR 증폭효율이 나쁜 primer로는 고감도 검출이 불가능하고 또 primerdimer 등 비특이적 증폭이 발생하기 쉬운 primer로는 정확한 정량이 어렵다. Primer 설계 전용 소프트웨어를 사용하여 다음과 같은 조건을 만족하는 primer를 설계하는 것이 중요하다.

  • 표적 DNA 서열에 안정되게 annealing 할 수 있다(Tm값이 적절한 범위).
  • PCR 반응효율이 좋다(Primer 내부 혹은 primer간에 상보적인 서열이 없다).
  • 특이성이 높다(template DNA상에 mis-priming하는 부위가 없다)

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