RNA spike-ins #
spike-in이라고 알려진 것은 DNA 혹은 RNA의 특정 서열을 탐지하기 위해 수십년 동안 사용된 Nucleic acid hybridization assay로부터 유래되었다. 해당 분석에서 특정 서열을 정량할 때 non-complementary DNA 서열에 RNA가 결합하는 것을 확인하고 보정하기 위해 control probe인 oligonucleotide를 사용하게 되었다. 이를 "spike-ins"로 부르기 시작하였다. 유전자 발현 분석을 위한 microarray나 RNA-seq 등에서 사용할 때는 RNA spike-in을 사용하게 된다. Spike-in이 알려져 있는 서열에 결합하는 과정을 hybridization이라고 부르고, 이들의 정도를 이용하여 normalization을 진행한다.
활용 #
발현량 비교를 할 때, 일반적으로 고정된 무게의 RNA(세포당 전사체의 총 수가 모든 조건에서 거의 일정하게 유지)에서 수행된다고 가정한다. 이 가정이 유의하지 않을 경우가 존재하는데, 예를 들면 세포 크기가 다른 세포 유형을 비교할 때이다. 상대적으로 발현량은 동일하나 단순히 큰 세포에서 RNA 무게가 더 많이 나가게 된다면 이를 read count로 계산했을 때 보정이 필요하게 된다. 레겐스부르크 대학(University of Regensburg)에서는 human cell과 Drosophila melanogaster cell을 혼합하여 전체 세포를 대상으로 spike-ins를 사용했고, 이들의 비대칭 유전자 발현 변화를 밝혔다.
그림 1. Human cell을 50만 개, 100만 개, 200만 개로 나누고 drosophila cell을 10만 개 섞은 후 spike-ins로 발현량을 보정하여 원래 비율로 맞추는 과정
spike-ins 기술은 small RNA(sRNA)에서도 활용할 수 있다. 다양한 샘플에서 sRNA level을 비교하려면 sRNA-Seq 데이터의 normalization이 필요하다. 일반적으로 정규화하는 방법의 경우 조직 간의 RNA 모집단이 작아 변동이 일어날 수 있어 해석이 잘못될 수 있다. 오스트리아 과학 아카데미(Austrian Academy of Sciences)에서는 이에 대한 spike-ins 세트를 개발하여 sRNA에 대한 정확한 정규화를 가능하게 하였다. 또한 sRNA 및 mRNA에 대한 각각의 spike-ins를 적용하여 genome-wide한 sRNA:mRNA stoichiometries의 추정을 가능하게 하였다.
그림 2. Arabidopsis thaliana의 꽃에서 sRNA에 대한 spike-ins 개발 및 mRNA와의 비율을 통한 density 계산
출처 #
- Jiang L, Schlesinger F, Davis CA, Zhang Y, Li R, Salit M, Gingeras TR, Oliver B. Synthetic spike-in standards for RNA-seq experiments. Genome Res. 2011 Sep;21(9):1543-51. doi: 10.1101/gr.121095.111. Epub 2011 Aug 4.
- Munro SA, Lund SP, Pine PS, Binder H, Clevert DA, Conesa A, Dopazo J, Fasold M, Hochreiter S, Hong H, Jafari N, Kreil DP, Łabaj PP, Li S, Liao Y, Lin SM, Meehan J, Mason CE, Santoyo-Lopez J, Setterquist RA, Shi L, Shi W, Smyth GK, Stralis-Pavese N, Su Z, Tong W, Wang C, Wang J, Xu J, Ye Z, Yang Y, Yu Y, Salit M. Assessing technical performance in differential gene expression experiments with external spike-in RNA control ratio mixtures. Nat Commun. 2014 Sep 25;5:5125.
- Taruttis F, Feist M, Schwarzfischer P, Gronwald W, Kube D, Spang R, Engelmann JC. External calibration with Drosophila whole-cell spike-ins delivers absolute mRNA fold changes from human RNA-Seq and qPCR data. Biotechniques. 2017 Feb 1;62(2):53-61.
- Lutzmayer S, Enugutti B, Nodine MD. Novel small RNA spike-in oligonucleotides enable absolute normalization of small RNA-Seq data. Sci Rep. 2017 Jul 19;7(1):5913.
- https://en.wikipedia.org/wiki/RNA_spike-in