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RAD-seq #
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Biology

RAD-seq #

RAD-seq (Restriction site-associated sequencing)은 차세대염기서열분석(Next Generation Sequencing; NGS) 기술을 이용한 염기서열 분석 기술 중 하나이다. 과거에 주로 이용했던 restriction fragment length polymorphism (RFLP)와 유사한 방식으로, 제한효소(restriction enzyme)를 이용해 제한부위(restriction site)에서 유전체를 자른 후 이 부분을 기준으로 하여 염기서열 분석을 진행한다. 방법 및 특징 면에서 genotyping by sequencing (GBS) 기술과 거의 유사하다. 주로 reference genome이 잘 알려져 있지 않은 non-model organism들에 대해 SNP genotyping 등의 유전분석을 진행할 때, 수 많은 유전자 마커에서 대규모의 변이 정보를 생산하기 위해 사용된다.

RAD-seq 진행 과정 #

  1. 제한 효소로 DNA 자르기

    실험을 진행하고자 하는 분류군에 적합한 제한효소를 선택하여 DNA 샘플에 처리한다. 적합한 제한효소는 유전체 내 효소가 인식할 수 있는 제한부위 밀도에 따라 결정된다. 실험 방식에 따라 둘 이상의 제한효소를 선택할 수 있으며, 주로 SBfI이나 PstI 등의 제한효소를 사용한다.

  2. Adaptor 붙이기

    제한효소로 잘린 DNA 조각들은 끝이 sticky end 상태로 남아있게 되므로, 이를 안정화하기 위해 adaptor를 붙여준다. 또한 이러한 adaptor에는 barcode가 들어있어 특정한 genomic DNA를 구별하는데 도움을 준다. RAD-seq은 주로 여러 genomic DNA를 한데 섞는 pooling 과정 이후 염기서열 분석을 진행하므로, 샘플마다 고유의 genomic DNA를 구분할 수 있어야 한다. 따라서 샘플별로 adaptor barcode 서열을 달리하여 염기서열 분석 이후 샘플을 구분해낼 수 있다.

  3. Multiplexing (Pooling)

    RAD-seq을 진행할 샘플은 제한부위를 포함한 유전부위의 DNA만을 가지고 있으므로, 분석할 유전 부위가 일반 NGS에 비해 적다. 따라서 여러 샘플을 한데 pooling하여 염기서열을 분석함으로써, 염기서열분석에 드는 여러 비용을 줄일 수 있다.

  4. Random shearing

    한 종류의 제한효소를 이용한 RAD-seq 방법의 경우, DNA 조각의 길이가 상당히 길 수 있다. 따라서 random shearing을 통해 DNA 조각을 작게 만든다.

  5. Size selection

    RAD-seq은 PCR amplification 과정과 NGS 과정을 걸치므로, 이 과정들에 적합한 길이의 DNA 조각만은 선별하여 남겨둔다. 이 과정을 통해 분석에 부적합한 DNA조각을 제거하므로, 염기서열 분석 효율이 증대된다.

  6. PCR amplification

    Size selection이 완료된 DNA 조각들에 대해 PCR amplification에 필요한 일부 전처리 과정을 진행한 뒤 증폭시켜, 분석하고자 하는 DNA sequence 양을 증폭시킨다.

  7. 염기서열 분석

    Illumina sequencing 등의 다양한 NGS 분석을 통해 염기서열 분석을 진행한다.

RAD-seq의 종류 #

RAD-seq은 library 생산 과정에서의 응용을 통해 다양한 방법으로 진행할 수 있다. 잘 알려진 RAD-seq 방법에는 다음과 같은 것들이 있다.

  1. RAD-seq (original)

    처음 사용된 RAD-seq 기법을 그대로 사용하는 방법이다. 한 가지 제한효소를 이용해 genome을 자르고, 다시 random shearing을 진행하고나서 size selection을 진행하는 library preparation 과정을 거친 후에 sequencing을 진행한다.

  2. 2bRAD

    IIB 제한효소를 이용해 제한부위로부터 일정 거리 떨어진 upstream 및 downstream 부분을 자름으로써, DNA 조각을 약 33 - 36bp의 일정한 길이로 잘라내는 library preparation을 진행한다. 일반 RAD-seq에 비해 size selection 과정이 필요하지 않다는 장점이 있다.

  3. ezRAD

    DNA를 잘게 자르는 제한효소를 하나 이상 사용하여 Illumina library preparation 방법에 최적화한 RAD-seq 방법이다.

  4. ddRAD

    Double digest RAD의 약자로, 두 개의 제한효소를 이용하여 양 끝에 각 효소에 특화된 adaptor를 붙여줌으로써 더 세부적인 library preparation을 진행한다. 하나의 제한효소만을 이용하는 일반 RAD-seq에 비해 효율이 높다.

RAD-seq의 장·단점 #

RAD-seq의 장점 #

  1. Genome assembly를 위한 reference genome이 반드시 필요치 않고, sequence library가 제한부위에 맞춰 정리되어 있기 때문에 sequence assembly 및 alignment가 whole genome sequence에 비해 쉽다.

  2. 제한효소로 잘린 일부 sequence만을 이용하기 때문에 적은 양의 sequencing을 통해서도 높은 read count를 얻어낼 수 있기 때문에 sequencing 효율이 높고 한 번의 sequencing시 여러 샘플을 pooling하여 진행할 수 있다.

  3. Whole genome의 일부만을 sequencing하는데 반해 제한부위는 genome 전반에 걸쳐 존재함으로 genome 전반에 걸친 DNA polymorphism 정보를 상당히 많이 얻어낼 수 있다.

RAD-seq의 단점 #

  1. Genotyping by sequencing (GBS)에 비해 library 제작 과정이 들어가므로, 추가적인 수고가 필요하다.

  2. 상당히 random한 부분들의 제한부위로부터 sequence 정보를 얻어내므로 분석 샘플 간 얻어낸 sequence 부분이 다름에 따라 missing data가 많이 발생한다.

  3. 제한효소로 잘린 sequence를 이용하기 때문에 assembly 진행이 어려워 유전자 정보나 유전적 구조 정보를 파악하기에는 어려움이 있다.

참고문헌 #

  1. Davey, J.W., Hohenlohe, P.A., Etter, P.D., Boone, J.Q., Catchen, J.M. and Blaxter, M.L., 2011. Genome-wide genetic marker discovery and genotyping using next-generation sequencing. Nature Reviews Genetics, 12(7), p.499.
  2. Davey, J.W. and Blaxter, M.L., 2010. RADSeq: next-generation population genetics. Briefings in functional genomics, 9(5-6), pp.416-423.
  3. Andrews, K.R., Good, J.M., Miller, M.R., Luikart, G. and Hohenlohe, P.A., 2016. Harnessing the power of RADseq for ecological and evolutionary genomics. Nature Reviews Genetics, 17(2), p.81.

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