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PCR #
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Experiment

개요 #

PCR (Polymerase Chain Reaction)은 중합효소 연쇄반응으로 DNA 서열 중 타겟하는 영역만을 목적으로 증폭시키는 기술이다.

PCR의 원리 #

PCR의 과정은 다음과 같이 세 단계로 이루어지게 된다. 해당 과정이 계속 반복하여 진행되면서(보통 25∼35회) 원하는 DNA 부분을 증폭시키는 것이 중합효소 연쇄반응의 원리이다.

  1. Denaturation
    94°C로 가열하여 double strand DNA를 single strand DNA로 분리시킨다.

  2. Annealing
    변성된 DNA와 primer를 혼합하여 온도를 낮추면 primer가 각각 상보적인 주형 DNA에 결합한다.

  3. Extension
    DNA polymerase를 작용시켜 primer를 신장시킨다.

PCR 반응액 #

  1. Template DNA
    증폭대상이 되는 DNA
  2. Primer
    증폭할 영역에 상보적으로 결합하는 oligonucleotide
  3. dNTP
    dATP, dCTP, dGTP, dTTP로 합성에 재료가 되는 nucleotide
  4. Taq polymerase
    유전자 합성 효소, primer와 DNA가 결합한 곳에서부터 DNA를 합성함
  5. MgCl2
    마그네슘 이온은 효소의 보조인자로서 효소 활성에 도움을 줌
  6. PCR buffer
    PCR 반응을 위한 완충용액으로 효소 최적활성에 필요한 환경을 제공함

PCR 종류 #

  1. Nested PCR
    첫 번째 PCR로 얻은 산물을 한 번 더 내부의 Primer를 사용하여 PCR하는 방법이다. Primer binding site에 의해 만들어지는 PCR의 오염을 줄여 target하는 영역을 효율적으로 증폭하기 위해 사용한다.

  2. Hot-start PCR
    PCR 반응 전 PCR mixture를 만들어 놓으면 상온에서 mismatched annealing과 polymerization이 일어날 가능성이 있으므로 Taq polymerase 또는 dNTP 등을 첫 번째 denaturation 이후에 넣어주는 방법이다.

  3. Real-time PCR (qPCR)
    Real time PCR법은 PCR 증폭산물의 증가를 실시간으로 모니터링하여 해석하는 기술이다. 기존의 PCR법에 비해서 정확한 정량이 가능하고 전기영동이 필요 없어 신속하고 간편하게 해석할 수 있으며, 오염의 위험성이 적다.

  4. RT-PCR
    Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction의 약자로 특정 부위의 RNA를 template로 하여 이에 상응하는 cDNA(complementary DNA)를 합성한 다음 이를 이용하여 PCR 증폭을 시행하는 기술이다.

PCR이 이용되는 실험 #

  1. Probe로 사용할 목적으로 cloning된 이중가닥 DNA의 증폭
  2. 적은 양의 mRNA로부터 특정 cDNA의 cloning
  3. DNA sequencing
  4. 돌연변이 검사
  5. 병원성 바이러스 및 박테리아 검출
  6. 유전자의 footprinting
  7. 특정 부위에 돌연변이를 일으킨 유전자의 제조(site directed mutagenesis)

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