Oxford Nanopore #

Nanopore에 대한 연구는 1990년대 중반에 하버드대학, 옥스포드대학 등에서 시작되었다. 그리고 곧, 바이오센서로서 사용이 제안되기에 이른다.'Oxford Nanopore'는 nanopore를 대학 연구 수준에서 전자공학 기반의 상업용 감지 기술 개발 단계로 끌어올리기 위해 2005년에 설립되었고, Nanopore science, 분자생물학, 전자공학 등을 전공한 150여명의 직원들이 한개의 분자를 직접적으로 분석하는 플랫폼을 개발해오고 있다.

옥스포드 나노포어 사의 홈페이지: https://www.nanoporetech.com/

아직까지는 DNA 시퀀싱에 좀더 포커스를 맞춰서 개발이 진행되고 있고, MinION™, PromethION™ and GridION™ 같은 'Oxford Nanopore'의 제품군을 준비하고 출시를 기다리고 있다. DNA, RNA, Protein과 같은 작은 분자들을 분석하는데 적합한 툴로서 기존의 NGS 장비에 비해 혁신적인 시퀀싱 원리를 가지고 있어 특히 MinION은 작은 USB 장치 만한 사이즈로도 High-throughput 시퀀싱이 가능하여 현장에서 즉시 검사가 용이할 것으로 기대된다. 이러한 장점으로 인해 검역/방역, 맞춤의학, 작물, 보안과 같은 다양한 분야에 사용될 수 있을 것으로 기대된다.

Nanopore의 이용 원리 #

Nanopore를 이용하면 분석체를 직접적이고, 전자적인 방법으로 확인할 수 있다. Nanopore는 전자적으로 저항성이 있는 막(생리적 용액으로 적신)에 구멍을 형성할 수 있고, 구멍이 생긴 막을 가로질러 전압이 걸리게 되는데, 이때 흐르는 전류를 측정한다. 분석체가 구멍을 통과할 때, 전류 흐름을 방해하는데, 이러한 현상이 분석체를 확인할 수 있게 해준다. 이것은 광학적인 표지 혹은 관심 분자의 증폭없이도 가능한 방법이다.

Nanopore fabrication에는 3가지 종류가 있다. 1. biological: formed by a pore-forming protein in a membrane such as a lipid bilayer 2. solid-state: formed in synthetic materials such as silicon nitride or graphene 3. hybrid: formed by a pore-forming protein set in synthetic material

Nanopore 시퀀싱 #

Nanopore protein은 한가닥의 DNA를 톱니바퀴처럼 한방향으로 밀어내도록 디자인된 enzyme과 결합되어 있다. 이러한 이유로 한 base씩 읽어내는 것이 가능하다.

현재의 시퀀싱 기술과 다르게 Nanopore는 핵산의 증폭과 형광 표지 및 광학기기 없이도 한개의 분자를 직접 측정할 수 있다. 한개의 nanopore를 실리콘 칩 위의 각 well에 심을 수 있기 때문에 실험을 확장할 수도 있으며, 실시간으로 데이터를 뽑아내고 분석할 수 있다.

동영상 링크: https://www.youtube.com/watch?v=3UHw22hBpAk

Nanopore 시퀀싱 논문 #

현재까지는 가장 작은 모델종인 박테리아의 E. coli와 가장 작은 진핵생물종인 yeast 게놈에 대해 nanopore 시퀀싱을 이용해 분석한 논문 두편이 올라와 있다. 향후에는 점차 더 큰 유전체 크기를 가진 모델종으로 그 적용 범위를 확대해 나가지 않을까 예상된다.

E. coli K-12 (4.6 Mb) #

<3번 레퍼런스 참조>

S. cerevisiae (~12.1 Mb) #

<4번 레퍼런스 참조>
보고된 에러율은 35% 정도로 높은 편이다
아웃풋은 MinION장비에서 48시간 가동했을때 평균 얼마정도 나오는지 통계자료가 나온 것은 없지만 논문에 의하면 몇몇 run에서는 490Mb 까지 나왔다고 하니 평균은 그보다 낮지 않을까 생각된다.
아직까지는 에러율이 너무 높아 PacBio와 같이 nanopore-only assembly가 가능하지는 않아보인다. Yeast genome assembly에서도 MiSeq 30x를 추가하여 hybrid 어셈블리를 수행한 결과를 보고하고 있다.

현재 옥스포드 나노포어는 MinION Access Program (MAP)이라고 하여 전세계 대학,연구기관들과 함께 MinION장비를 이용한 베타테스트를 수행중에 있으며, 하나씩 하나씩 나노포어를 활용한 성과들이 과학저널에 실리고 있는 상황이다. 이 프로그램을 통해 보다 향상된 시퀀싱 결과 (시퀀싱 정확도, 높아진 아웃풋)와 함께 나노포어 시퀀싱 결과를 효과적으로 해독할 수 있는 프로그램의 개발/효율화도 시퀀싱 커뮤니티와 함께 수행해 나가고 있다고 보여진다.

어느정도 안정화가 되었을때 본격적으로 시장에 상품으로 판매를 시작하지 않을까 예상된다.

DNA 시퀀싱이 생명과학 분야에서 기본적인 툴이 되어가고 있고, 몇몇 진단 분야에서도 사용되고 있지만 기존의 시퀀싱 기술은 여전히 제한이 있다. 긴 read, 개선된 워크플로우, 심플한 분석 등 다양한 장점을 가진 Oxford Nanopore의 기술이 연구자들의 기대를 충족시키고, 시퀀싱 시장의 판도를 흔들 수 있을지 궁금해진다.

References #

1. 2008, Nature Biotech., The potential and challenges of nanopore sequencing.
2. 2014, Bioinformatics, Poretools: a toolkit for analyzing nanopore sequence data.
3. 2014, GigaScience, A reference bacterial genome dataset generated on the MinION portable single-molecule nanopore sequencer.
4. 2015, bioRxiv, Oxford nanopore sequencing and de novo assembly of a eukaryotic genome.