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Next-generation sequencing #
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Analysis

Next-generation sequencing (NGS)이란 ? #

대용량의 시퀀싱 데이터를 생산하는 것으로 현재는 한번에 3 Tb (illumina NovaSeq 6000)의 염기서열을 읽어 낼수 있다. 혁신과도 같은 기술로 유전체학 분야의 비약적인 발전을 이끌었으며, 현재는 생명과학 전반에 걸쳐 그 사용 범위가 확대되었다.

어느 분야에 활용 가능한가? #

유전체, 전사체, 변이체, 후성 유전체를 비롯해 기본적인 시퀀싱으로 연구 가능한 분야 전반에 활용되고 있다. 특히 Human 유전체의 경우 개인 유전체 연구를 통해 각종 개인 맞춤형 의료 서비스 및 식품서비스가 가능하도록 하였다.

유전체 #

진화 연구, 농수산물 및 가축의 육종, 기후 변화에 따른 생태학적 생물들의 유전체 서열을 구축하여 많은 분야에 잠재적인 유전정보를 제공하고 있다. 실예로 human genome의 경우 1990년에 시작하여 10여년이 넘게 sanger sequencing 기술을 토대로 진행하여 2003년 4월 3Gb의 유전체를 완성한 이후 현재 memory T cell 하나하나의 발현정보까지 시퀀싱 데이터로 연구가 진행되도록 하고 있다. 현재 식품으로 우리의 식탁에 올라오는 99%의 것들이 유전체 정보가 밝혀져 있고, 연구되어지고 있다. NGS 덕분으로..

전사체 #

주어진 환경적 조건, 발달 단계 및 조직에 따라 유전자의 발현량은 모두 다르다. 이를 시퀀싱 기술을 이용하여 mRNA 서열을 랜덤하게 캡쳐하여 시퀀싱에 적용하여 양적인 수치로 전환하여 연구하는 것이 전사체 연구이다.
암, 약리학적 효과, 특정 방어 시스템 연구등 다양한 분야의 유전자 발현 연구를 위해 이용되고 있다.

변이체 #

단일 염기 변이를 대상으로 개인 유전체를 비롯한 육종 분야에 많이 활용되고 있다. 유전체 서열내에 존재하는 변이 정보를 대용량의 시퀀싱을 통해 밝힌후 표현형과 유전형의 상관성을 주로 연구한다. 자세한 사항은 GWAS 분야를 참조.

후성 유전체 #

Methylation, Acethylation과 같은 후성학적 연구에 이용된다. 유전체 전반에 걸친 methylation 및 acethylation 패턴을 특정 컨디션을 대상으로 확인한다. ( 꼭! 전사체 연구와 함께 진행 하시길 추천드립니다.)

어떤 장비가 어떤 원리로 이용 되는가? #

NGS 장비는 1세대, 2세대, 3세대로 구분된다. 그 기준은 PCR과 laser를 이용하는 기준에 따라 구분된다.

1세대, 2세대 NGS 장비 - illumina NovaSeq/ HiSeq /NextSeq #

PCR과 laser 모두가 이용되는 방식으로 DNA 조각을 짧은 단편으로 자른후 이를 PCR로 증폭시켜 1 bp씩 합성 하고 terminator로 반응을 멈추고 laser로 빛을 쏘아 어떤 염기가 합성되었는지 확인한후 다시 1 bp를 합성하는 방식을 반복적으로 수행하여 최대 150bp까지 읽도록 했다. 이는 보통 illumina 방식이라 일컫어 진다. 주의할 점은 PCR이 수행되는 만큼 샘플의 서열에 GC%가 높다면 PCR 바이어스가 존재할수 있어 특정 영역만 주로 시퀀싱이 될수도 있음을 주의 해야 한다.

2.5 세대 NGS 장비 - Ion Torrent- PGM / Pacbio-sequel #

PCR과 laser중 한가지만 사용하는 방식으로 ion Torrent가 이에 해당한다. Ion Torrent는 PCR은 수반되나 laser로 확인하지 않고, 새로 합성된 염기 서열을 알아낼때 4개의 염기 서열 (ATP, CTP, GTP, TTP)모두를 순차적으로 반응 시킨후 합성되고 난 후 떨어져 나오는 수소 이온의 농도를 이용한 전기적 차이를 이용하여 확인한다. 즉, ATP를 넣어 반응 시켰을 경우 전기적 차이가 없는 반면, CTP를 넣어 반응 시켰을때 전기적 차이가 발생 됐다면 합성된 염기 서열은 C로 확인될수 있다. Laser로 확인이 필요 없는 만큼 장비의 크기가 매우 작아져 일반 PC 모니터의 크기로 줄게 되었다. 그러나 한번에 읽어낼수 있는 용량이 다른 장비들에 비해 작은 단점과 PCR 바이어스는 그대로 존재한다.

또다는 2.5 세대 장비로 PacBio 시퀀싱 장비가 있다. 이는 PCR 반응은 없고 laser 만이 이용된다. PCR이 없는 만큼 염기서열을 짧은 서열로 자르지 않아도 되며 길게 읽을수 있는 장점있다. 현재 de novo 유전체 연구 분야에 가장 많이 활용되고 있다. 작은 공간에 염기 조각을 로딩하고 그 염기조각을 DNA polymerase로 합성하면서 laser로 순차적으로 읽어내는 방식으로 준비된 염기서열의 퀄러티만 좋다면 Mega base 까지로 읽어낼수있다. 다만 장비가 매우 큰 단점과, error rate 이 다른 장비에 비해 다소 높은 단점이 있다.

3세대 장비- Oxford - Nanopore #

비로소 PCR과 laser를 모두 사용하지 않는 아주 간소한 크기의 (아이폰만한크기도 있음) NGS 장비로 oxford nanopore가 등장했다. DNA 이중 나선을 helicase가 풀어서 일정한 막을 통과시킬때, 막의 전위차를 감지하여 염기서열을 확인하는 방식이다. 준비된 염기서열의 purity가 매우 중요하게 작용하는 요소로 읽혀지는 염기서열의 양을 모니터로 실시간 확인하면서 최종 시퀀싱 양을 결정하여 반응을 조절할수 있다. 만약 로딩된 염기서열의 퀄리티가 좋지 않아 처음 반응에 대부분의 pore가 반응하지 않는 다면, 바로 반응을 멈추고 kit를 씻어 다시 시퀀싱라이브러리를 제작하여 로딩할수 있다 (초반 3시간 정도 모니터링 하여 결정하면 족하다) PCR이 없는 만큼 긴 조각의 염기서열 정보를 얻을수 있으며, laser가 없는 만큼 매우 간소해진 크기를 자랑하고 있다.

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