MLST(Multi-locus sequence typing) #

세균을 분류하는 분자 수준의 방법에는 여러가지가 있으며, 대표적으로 DNA:DNA hybridization, Ribotyping, MLST, Fatty acid analyses, rRNA sequencing 등이 있다. rRNA sequencing, Ribotyping이 비교적 쉽고 간단하게 이용되는 방법이지만 하나의 유전자에만 초점을 맞춰 분석이 되기 때문에 제한적이다. 따라서 MLST 방법을 많이 활용하고 있다. MLST는 Multi-Locus Sequence Typing의 약자로 약 6~7개의 house keeping 유전자를 PCR 증폭하여 염기서열을 확인한 후 그 차이를 비교함으로써 동일 종 내의 균주들의 특성을 확인할 수 있는 방법으로 1998년 수막염 및 패혈증의 원인균인 네이세리아의 종 Neisseria meningitidis를 빠르게 동정하기 위해 개발되었다. 이 방법은 진화적으로 가까운 생물의 서로 다른 몇 개의 필수(housekeeping) 유전자들의 DNA 염기서열 분석을 수행하고 이를 통해 이 생물 종들을 구별하는데 사용된다. 처음에는 인간 병원균에만 적용하였으나 최근에는 식물병원균 등 다양한 분야에서 활용되고 있다. 다좌위 서열 구분법은 종 내에서 매우 밀접하게 연관되어 있는 균주(strain)들도 구별할 수 있을 정도로 높은 해상력이 있다. 실제로, 분석된 유전자들 중 한 개의 유전자에서 단 하나의 염기서열의 차이에 근거하여 균주를 구별 할 수도 있다. 젤 전기영동을 통한 구분법과 비교하여 다좌위 서열 구분법의 가장 큰 장점은 염기서열 정보가 명확하고 대립유전자 정보를 인터넷을 통해 데이터베이스와 쉽게 비교할 수 있다는 것이다. 그러나 다좌위 서열 구분법은 종 수준보다 상위의 생물을 비교하는 데는 유용하지 않은데, 이는 다좌위 서열 구분법의 해상력이 너무 민감하여 속(genus)이나 과(family)와 같은 상위의 분류군에 대해서는 의미있는 정보를 줄 수 없기 때문이다. 다좌위 염기 분석(multilocus sequence analysis; MLSA)과 매우 유사하며 다좌위 서열 구분법은 염기서열 분석 후 대립형질을 사용하여 미생물 종을 구분하지만, 다좌위 염기 분석은 필수유전자들의 서열을 연결한 후 연결된 염기서열을 바탕으로 계통학적 분석을 수행한다.

MLST 분석 과정 #

미생물의 종 수준 혹은 종 수준 내의 유연관계를 판단하기 위해서는 빠르게 진화하는 유전자를 탐색하여야 한다. 이때 하나의 유전자가 아닌 5~7개의 필수유전자를 한꺼번에 서열 분석하여 비교하는데 여러 유전자를 한번에 분석하는 것은 수평적 유전자 이동(horizontal gene transfer)으로 인한 잘못된 해석을 피하기 위함이다. 필수유전자들은 세포에서 필수적인 기능을 암호화하고 있으며 항상 플라스미드보다는 염색체에 위치한다.

구별하고자 하는 미생물종의 약 7개의 유전자를 목적에 따라 선정하고 각 유전자 당 450~500bp 염기서열을 중합효소연쇄반응(PCR)방법으로 증폭하여 염기서열을 얻는다. 그 후에 여러 미생물로부터 얻어진 같은 유전자들의 염기서열들을 서로 비교하여 같은 염기서열을 갖는 유전자들에 대해서는 같은 번호를 매기고, 적어도 하나 이상의 염기서열에 차이가 나는 유전자 즉 대립유전자에 다른 번호를 부여한다. 보통 각 균주의 한 개의 유전자에 10~30개의 대립유전자가 나타난다. 그 후 균주들에 일련의 숫자로 구성된 다좌위 서열타입(Multilocus sequence type)을 부여하게 되는데, 이 일련의 숫자는 대립유전자의 특정 조합으로 구성한다. 다시 말해서 한 종내 각 균주는 일곱 개의 대립유전자에 해당하는 일곱 개의 숫자로 이루어진 특징을 부여받게 된다. 유전자당 평균 30개의 대립유전자가 있을 때 약 200억 개의 유전형(genotype)을 구분할 수 있게 된다. 각 대립유전자 프로파일 간의 유연관계는 동일한 균주를 나타내는 0부터 아주 먼 유연관계를 가지는 1까지 다양한 연관 거리를 보여주는 덴드로그램(dendrogram)으로 나타낸다.

사용되는 유전자 및 데이터베이스 링크 #

• 나이세리아(Neisseria): PorA / porB /FetA / fHbp / NHBA /NadA (link: http://pubmlst.org/neisseria/ )
• 녹농균(Pseudomonas aeruginosa): acsA / aroE / guaA / mutL / nuoD / ppsA / trpE (link: https://pubmlst.org/paeruginosa/ )
• 디프테리아균(Corynebacterium diphtheria): atpA / dnaE / dnaK / fusA / leuA / odhA / rpoB (link: https://pubmlst.org/cdiphtheriae )
• 바실러스(Bacillus): glpF / gmk / ilvD / pta / pur / pycA / tpi (link: https://pubmlst.org/bcereus/ )
• 버크홀데리아 세파시아(Burkholderia cepacia): atpD / gltB / gyrB / recA / lepA / phaC / trpB (link: https://pubmlst.org/bcc )
• 비브리오(Vibrio): gyrB / pyrH / recA / atpA (link: https://pubmlst.org/vibrio )
• 아크로모박터(Achromobacter): nusA / rpoB / eno / gltB / lepA / nuoL / nrdA (link: https://pubmlst.org/achromobacter/ )
• 여시니아(Yersinia): aarF / dfp / galR / glnS / hemA / rfaE speA (link: https://pubmlst.org/yersinia/ )
• 캄필로박터(Campylobacter): aspA / glnA / gltA / glyA / pgm / tkt / uncA (link: https://pubmlst.org/campylobacter/ )
• 황색포도상구균(Staphylococcus aureus): arcC / aroE / glpF / gmk / pta / tpi / yqi (link: https://pubmlst.org/saureus/ )

MLST 응용 #

주로 세균 동정에 이용되며, 일반적으로 색 역학적 방법(항원-항체반응을 이용한 응집반응, ELISA 동정 등)을 사용하는데 다양한 대립 유전자 조합을 통해 매우 밀접한 유연관계가 있는 균주까지도 구별할 수 있다. MLST에서 가장 활발하게 이용되고 있는 분야는 의학으로 균주마다 병원성을 가지고 있는 세균은 그렇지 않은 세균과 차이를 분리해 내는것이 매우 중요하다. 이런 분류에 MLST는 굉장히 효과적인 분석 방법이 될 수 있다.

wgMLST와 cgMLST #

MLST는 지난 15년 동안 박테리아의 분자 유형 지정에 대한 유용성이 입증되었다. 현재는 NGS 플랫폼의 발전으로 박테리아 게놈의 서열 결정을 빠르고 비용이 효율적인 차세대 시퀀싱이 점점 더 sanger 시퀀싱을 대체함에 따라 기존 MLST가 전체 게놈 MLST(wgMLST)로 확장 되고 있다. 더 많은 유전자좌(일반적으로 1500 – 4000)가 wgMLST에서 고려되기 때문에 훨씬 더 높은 타이핑 해상도를 얻을 수 있다.

전체 게놈의 wgMLST는 대립유전자 변이의 개념을 기반으로 한다. 여러 위치의 재조합 및 삭제 또는 삽입이 단일 진화 이벤트로 계산되며 이 접근법은 점 돌연변이만을 고려하는 접근법보다 생물학적으로 더 적절할 수 있다.

이 기술의 주요 단점은 대립 유전자 큐레이션이 필요하다는 것이다. 적절한 자동화 도구가 없는 경우 수천 개의 유전자좌에 대해 일관된 대립유전자 정보를 유지하는 것은 굉장히 어려운 작업이다. 이를 수용하기 위해 자동화된 큐레이션 도구가 필요하며, 공통적으로 사용 가능한　ｓｈｅｍｅ이　아직까지　분석을　진행하는　한계의　요소로　작용하고　있다．

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