KASP Genotyping Assay #

개요 #

KASP는 Kompetitive Allele Specific PCR genotyping system의 약자로 LGC社에서 개발 및 판매하는 genotyping assay system이다(실제로 KASP technology 개발은 Kbiosciecne에서 했고, 후에 LCG社가 Kbioscience를 인수하게 된다).

KASP assay는 글자 그대로 competitive allele-specific PCR의 원리를 이용하고 있으며 SNP의 bi-allelic scoring과 특정 loci의 insertions and deletions 여부를 확인하는 것이 가능하다. 실험방법이 간단하고, 다른 Genotyping assay들에 비해 가격적인 장점이 있으며, 96, 384, 1536well plate에서 실험이 가능하다. 또한 이미 2,000편 이상의 논문(주로 식용 동,식물)에서 그 정확성이 검증되었기 때문에 bi-allelic scoring과 indel을 확인해야 하는 대규모 과제에 적합한 system이라 할 수 있다.

방법 #

실험 과정을 좀 더 상세히 설명하면, LGC는 KASP 실험을 하고자 하는 연구자에게 두개의 tube를 제공한다. KASP Assay Mix와 KASP Master Mix가 그것인데, Assay Mix에는 label되어있지 않은 두개의 allelic specific forward primer(이 primer에는 FRET cassettes와 상보적인 시퀀스를 가진 oligo tail이 붙어있다. FRET cassettes는 DNA 조각이고 2중 구조이다. 한쪽에는 형광 dye, 다른 한쪽에는 형광 dye를 비활성화 시키는 quencher가 붙어있다. 이러한 FRET cassettes는 FAM, HEX 두 종류가 있다), 그리고 한개의 reverse primer가 들어있다. Master Mix에는 universal FRET cassettes, ROX™ (passive reference dye), taq polymerase, nucleotides, MgCl2 가 들어있다. PCR 반응이 시작되면서 allele-specific primer가 template에 붙고 elongation이 진행된다. 이 때 새롭게 만들어진 strand에 tail sequence가 붙어있는 상태가 된다. 다음 스텝에서 allele-specific tail sequence 의 complement가 생성된다. 그리고 FRET cassette가 붙게되고 quencher와 떨어지면서 형광 시그널이 나오게 되는데, 만일 genotype이 homozygous라면 두개의 형광중 한개만이(FAM or HEX), heterozygous라면 두 종류의 형광 시그널이 함께 detection 된다(FAM and HEX).

참고문헌 http://www.lgcgroup.com/products/kasp-genotyping-chemistry/#.VVV3jnmJipo

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