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Hot-start PCR #
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Experiment

Hot-start PCR #

Hot-start PCR을 하는 이유 #

PCR을 수행하기 위해서는 Primer가 반드시 필요하다. 이 primer가 annealing이 되어 elongation이 진행되는데 그 때의 온도를 Tm(melting temperature)라고 한다. Primer의 Tm값은 대게 섭씨 55도씨 전후이다. PCR에서 중요한 역할을 하는 중합효소의 활성온도의 범위가 넓어 primer의 Tm 값에서도 활성을 보인다. 중합효소는 적정 온도에 올라가 specific하게 서열을 증폭시켜야 하는데, 낮은 온도에서 활성이 일어나게 되면 non-specific 증폭이 일어나게 된다. 따라서 중합효소가 활성을 가지는 높은 온도에서 target DNA에 specific하게 증폭을 시킥 위하여 hot-start PCR을 이용한다. 다만 primer가 한 종류일 경우에는 non-specific한 증폭의 위험이 적어 꼭 사용하지 않아도 된다.

Hot-start PCR 방법 #

Wax를 사용 #

PCR을 위해 필요한 reagent를 모두 혼합한 다음 왁스를 넣어 상부를 굳힌다. 그 위에 template 및 primer를 혼합하여 넣는다. 왁스를 기준으로 하부에는 reagent mixture가 상부에는 DNA가 존재하게 된다. 원하는 온도만큼 상승하게 되면 굳었던 wax가 녹으면서 상부층과 하부층이 섞여 PCR이 진행된다. 녹은 왁스는 상부층에 떠 고온에 수중기가 된 수분증발을 막는 역할도 한다.

Monoclonal antibody 사용 #

PCR의 증폭과정에서 가장 중요한 중합효소를 antibody를 이용해 불활성화 시켜 이용하는 방법이다(혹은 Mg2+ 이용). 온도가 올라가면서 antibody가 중합효소로부터 떨어져 나와 효소가 고온에서 활성을 갖게 된다. 효소가 활성을 가지게 되면서 DNA증폭 과정이 시작된다.

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Reference #

Figure : http://dx.doi.org/10.1371/journal.pone.0027248

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