Heterologous expression #

(Huo, Liujie et al. Natural product reports vol. 36,10 (2019): 1412-1436. doi:10.1039/c8np00091c)

Heterologous expreesion(이원적 발현)은 host 생물이 원래는 지니지 않는 특정 유전자나 유전자 일부를 발현하는 것을 말한다.

유전자를 heterologous host에 삽입하는 것은 다양한 DNA 재조합 기술을 수행 가능하다. Heterologous expreesion의 목적은 여러 가지가 있지만 일반적으로는 돌연변이가 단백질의 기능에 미치는 영향이나 단백질의 상호작용을 확인하는 데 사용된다. 이는 자연적으로 발생하지 않는 유전자와 mutant 유전자의 조합을 간단하게 실험하고 효율적으로 발현하는 것을 가능케 한다. Heterologous expression은 Host 생물의 지놈에서 외부 유전자가 존재하는 기간에 따라, 두 가지 유형으로 구분된다.

종류 #

외부 유전자의 유지 기간에 따라 #

Permanent integration (Long-term heterologous expression) #

(Zhang, Jia Jia et al. Methods in enzymology vol. 621 (2019): 87-110. doi:10.1016/bs.mie.2019.02.026)

외부 유전자가 host 생물의 genome에 완전히 integration되어 영구적으로 통합되는 경우를 permenent integration (또는 Stable expression)이라 한다. 이렇게 integration이 일어날 경우 이후 host가 계대배양 되더라도 유지된다는 장점을 지닌다.

Permenent integration은 주로 어떤 화합물의 Native host가 생산효율 또는 배양의 어려움 등의 요인에 의해서 비효율적일 경우, 해당 화합물을 생산하는 생합성 유전자 클러스터(BGC, Biosynthetic gene cluster)를 다른 host 생물로 옮겨 더 효율적으로 발현할 때 사용된다.

Transient expression (Short-term heterologous expression) #

Transient expression은 일반적으로 1~3일 동안 지속되는 일시적인 heterologous expression을 의미한다. 이 경우 도입된 외부 유전자는 일정 기간 뒤에 사라지기 때문에 다양한 활용이 가능하다.

예를 들어 CRISPR-Cas9 system을 이용해 생물체의 genome을 편집할 때도, genome 편집을 끝마쳐 역할을 다한 Cas9 단백질이 생물체에 남아있는 것은 불필요한 영향을 줄 수 있기 때문에 이를 제거하는 것이 필요하다. Transient expression을 이용하면 CRISPR-Cas9 system에 이용된 벡터는 자연스럽게 제거되기 때문에 이 경우 유용할 수 있다.

발현의 지속성에 따라 #

Constitutive expression #

재조합 유전자가 Host의 생장 초기에서부터 지속적으로 발현되는 것을 Constitutive expression이라 한다.

Inducible expression #

연구자가 원하는 시기에 재조합 유전자를 발현하는 것을 Inducible expression이라 한다.

Producer 세포(host cell)에서 화합물을 성공적으로 과량 생합성 하기 위해서는 생장 초기 단계에서 Constitutive expression은 지양하고, 세포의 밀도가 충분히 높아진 생장 후기 단계에서 과량 발현하는 것이 일반적으로 유리하다.

그 이유로는 몇 가지가 있는데 첫째, producer 세포의 metabolic capacity를 단백질 생산으로 분산시켜 세포가 생장하고 분열하는 것을 방해할 수 있다. 둘째, 외부 유전자의 발현 결과물이 producer 세포에 어느 정도의 toxicity를 지니는 경우 유전자를 일찍 발현하는 것은 세포를 죽일 수 있다.

유전자 도입 방법 #

Electroporation #

고전압의 전기를 이용하여 세포의 막에 구멍을 생성하는 방법인 electroporationㅇ은, 짧은 시간 전기를 가해 세포막의 일부분이 일시적으로 불안정해지고, 이를 통해 DNA가 세포 내로 들어갈 수 있게 된다. 적절한 세기의 전기장을 이용하면 acceptor 세포에 대한 손상이 최소화하면서 빠르게 DNA를 전달할 수 있어 널리 쓰인다.

Viral transduction #

바이러스 전달은 바이러스 벡터를 사용하여 유전자를 대상 세포에 안정적으로 도입하는 방법이다. 이 방법에서는 바이러스 벡터(또는 바이러스 입자)가 DNA를 세포의 핵으로 직접 운반하는 방식으로 수용체 세포를 감염시킨다.

Bacterial conjugation #

Bacterial conjugation은 세균성 세포들에서 일어나는 유전 물질 전달 방법으로, 두 세포 사이에 다리가 놓이는 것처럼 직접적으로 연결되어 유전 물질의 전달이 일어난다.

Host 선택 #

Escherichia coli #

재조합 단백질들의 상당부분은 가장 일반적인 발현 시스템인 미생물, 특히 E. coli에서 발현된다. E. coli는 생장 속도가 상당히 빠르며, 현재까지 가장 많이 연구된 미생물 중 하나이므로 유전자 조작이 쉽다는 장점을 지닌다. 단, E.coli에서는 번역 후 변형(Post-translational modification)이 불가능하며, 대부분의 단백질들이 세포 내부에서 생산된다는 단점을 지니고 있다.

Streptomyces #

그람-양성 토양균인 streptomyces 또한 비병원성이며 특성이 잘 알려져 있다는 특징 때문에 heterologous expression의 host로 널리 사용되고 있다. Streptomyces의 가장 큰 장점 중 하나는 많은 양의 단백질들을 세포 외부로 분비하는 능력이 뛰어나다는 것이다.

Yeast #

Yeast는 상대적으로 저렴한 배지에서 빠른 생장 속도를 보인다는 장점을 지니며, 예로부터 맥주의 생산과 제빵에서 핵심적인 역할을 수행하면서 축적된 데이터가 많다는 특징을 지닌다. 또 한 가지의 장점은 E. coli와는 다르게 Eukaryote이기 때문에 번역 후 변형(Post-translational modification)이 가능하다는 것이다.

단점으로는 일반적으로 발현 정도가 낮으며, 분비 시스템이 그리 발달하지 않았기 때문에 재조합 단백질들이 항상 성공적으로 분비되지 않는다는 것이 있다.

Fungi #

Insect #