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Enterococcus 항생제내성 및 감수성 시험 #
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Experiment

검체 채취 및 보존 #

장알균의 검체 채취 및 수송은 일반적인 방법에 따른다. 분리된 균부는 동결건조하거나 10% glycerol 또는 10% skim milk, 피브린이 제거된 양 또는 토끼 혈액이 포함된 Brain infusion broth에 균량을 많이 접종하여 보관한다.

장알균 분리 #

수송배지에 들어있는 분변 및 장 분비물 검체균을 Enterococcosel TM (BBL,Becton Dickinson Microbiology System, USA) 선택배지에 도말하여 35℃에서 24시간 배양한 후 흑색 집락을 선별한다. 그 후 선별된 집락을 5% 양혈액이 함유된 Tripticase soy agar (TSA)에 재접종하여 35℃에서 24시간 배양한 후 성장한 균주에 대하여 6.5% NaCl broth, 40% bile agar에서 성장 유무, MGP (Methyl-α-Dglucopyranoside) 산화검사와 색소형성능 검사 등을 실시하여 장알균을 분리한다. MGP 산화검사는 phenol red broth base에 1% MGP를 첨가하여 35℃에서 배양하면서 1일과 2일째 관찰하여 황색으로 변하면 양성으로 판독한다.

장알균 배양 및 특성 #

장알균 배양에는 Trypticase Soy-5% 양 혈액 한천배지, brain heart infusion-5% 양 혈액 한천 배지나 기타 다른 혈액배지를 사용한다. E. faecalis의 일부균주는 토끼, 말, 사람혈액에서는 β-hemolysis를 일으키나 양혈액에서는 β-hemolysis를 일으키지 않는다. E. durans는 혈액 종류와 관계없이 β-hemolysis를 일으키며 배양온도는 35~37℃이고 일부 균주는 CO2 농도를 증가시키면 더 잘 자란다. 배양할 검체에 그람음성균이 있으면 BE azide, Pfizer selective enterococcus 등 azide가 포함된 배지가 일차 분리배지로 좋다. 이외에 최근에는 감별 능력이 높은 기질이 포함된 배지가 일차 선택배지로 사용되고 대변검체처럼 심하게 오염된 검체에서 E. faecium 만을 감별 분리할 때는 cephalexin- aztreonam-arabinoseagar가 사용되고 있다. 카탈라제 음성 그람양성알균인 장알균 중 주로 사람에서 분리한 균의 표현형적 특성은 표 1과 같다.

생화학적 시험에 의한 균종 동정 #

장알균은 mannitol과 sorbose로부터 산생성능, arabinose의 가수분해 등 주요 표현형적 시험에 따라 동정한다. E. faecalis, E. faecium, E. casseliflavus, E. gallinarum, E. muandtii는 mannitol 로부터 산을 생성하고 arginine을 가수분해하나 sorbose로부터 산을 생성하지는 않는다. 비정형 균주는 arginin 등 분해하지 못하거나 mannitol로부터 산을 생성하지 않는다. E. casseliflavus와 E. gallinarum의 비운동성 변이주는 MGP로부터 산생성능으로 동정을 하고 E. faecium과 E. mundii는 산생성능이 없다. E. avium은 mannitol과 sorbose, arabinose, sorbitol로부터 산을 생성하나 arginine을 가수분해하지는 않는다. E. durans, E. hirae는 arginins을 가수분해하나 mannitol과 sorbose로부터 산생성능은 없다

PCR 동정 #

PCR에 의한 장알균의 균종 동정은 표 2와 같이 각 균종별 특이 primers를 이용하여 수행한다.

상품화 킷트와 분자생물학적 방법에 의한 동정 #

장알균 동정에는 여러 가지 수동, 반자동, 자동시스템이 있다. 장알균 동정에는 API 20S, API rapid ID32 STREP systems (bioMerieux, Hazelwood, Mo.), Crystal Gram-Posive and Crystal Rapid Gram-positive 동정시스템 (Becton Dickinson Microbiology Systems)과 Vitek (bioMerieux)의 Gram positive identification card와 MicroScan Walk Away system (Dade Microscan, West Sacramento, Calif.)의 Gram-Positive Identification panel이 이용되고 있다. 일부 동정시스템은 80% 정도가 일치하고 있으나 정확도는 균종분포에 따라 차이가 있다. 분자생물학적 방법으로는 DNA-DNA hybridization과 16S rRNA 유전자 염기서열 분석 등이 있는데 주로 특정 실험실에서 분류학적 목적으로 많이 사용하고 있다. 분자생물학적 방법은 SDS-PAGE에 의한 whole- cell protein (WCP) profile 분석, vibrational spectroscopic analysis, RAPD, 16S rRNA fragment length polymorphism analysis, 16S rRNA의 broad-range PCR, 23S rRNA 유전자의 domain V의 sequencing, tRNA나 rRNA intergenic spacers, D-Ala:D-Ala ligases (ddl), 반코마이신 내성유전자 분석 등 이다. 특히 WCP-profile의 SDS-PAGE 분석은 종 특이적이고 장알균의 정형, 비정형균을 구별할 수 있어 균종동정에 추천되고, 16S rRNA 유전자의 염기서열 분석은 모든 장알균에 적용이되며 GenBank를 통해 비교가 가능하다.

분자형별 분석 #

항생제 내성을 가진 장알균의 확산과 병원내 집단발생 연구와 특히 VRE의 감염관리 및 역학조사를 위한 발생증가의 관점에서 분자생물학적 형별분석은 매우 중요하다. 형별분석에 최근 분자생물학적 기법을 적용함으로서 장알균의 변별력을 향상시키고 역학적인 관점에서 중요한 자료를 제공함으로서 환자 중 직․ 간접적으로 접촉하여 외부에서 획득되는 균주의 증명이 가능하여 병원내 전파나 병원간 확산을 확인할 수 있다. 장알균 형별분석에는 plasmid profile과 genomic DNA restriction enzyme analysis과 최근에는 PFGE (Pulsed Field Gel Electrophoresis)이나 counter-clamped homogeneous electric field electrophoresis에 의한 chromosomal DNA restriction profile 등이 사용되고 있다. 이외에도 장알균간에 유전적 연관성을 보기위해 multilocus enzyme electrophoresis, ribotyping, RAPD PCR, repetitive-element sequence PCR 등이 이용되고 있다. 또한 PCR 산물의 염기사열분석, RFLP가 추가로 쓰이고 있다. 이들 방법 중 현재 PFGE가 가장 신뢰성이 높고 변별력이 좋은 것으로 알려지고 있으나 고가 장비를 갖춰야 하고 실험실간 전기영동 조건 등이 다를 경우 실험실간 PFGE 패턴 비교가 어렵다는 것이 제한점이다.

항생제 내성 #

장알균에서 주요 문제는 항균제 내성이 높고 E. faecium은 E. faecalis 보다 높은 내성을 나타낸다.

자연내성 #

장알균은 세파로스포린, penicillinase-resistant penicillin, monobactam에 자연내성이다. 많은 아미노글리코사이드의 저도내성을, fluoroquinolone에 중간내성에서 내성을 보이고 페니실린과 암피실린에 대해서는 streptococci 보다 10~1000배 정도 감수성이 낮다. 장알균은 β-lactam (암피실린)에 저해되나 죽지는 않는다. 장알균이 본래 내성인 aminoglycoside, aztreonam, cephalosporins, clindamycin, methicillin, trimethoprim-sulfamethoxazol의 표준농도에 대해서는 시험할 필요가 없다. 이들은 시험관내에서 활성이 있어도 임상적으로는 유효하지 않으므로 감수성으로 보고해서는 안된다.

아미노글리코사이드에 내성 #

세포벽에 활성이 있는 항생제 (페니실린이나 반코마이신)와 아미노글리코사이드 (스트렙토마이신 또는 겐타마이신)과의 병합치료는 심내막염과 같은 증증감염증 치료에 중요하다. 장알균이 아미노글리코사이드에 본래 저도 내성 (MIC < 500 ㎍/㎖)을 나타내지만 세포벽에 활성이 있는 항생제와 병합사용하면 감수성이 상승한다. 그러나 아미노글리코사이드에 고도내성 (MIC > 500 ㎍/㎖) 균주는 이런 상승작용을 기대할 수 없어 장알균에 의한 중증감염증 치료효과를 예측하기 위해서는 겐타마이신과 스트렙토마이신 고농도에 대한 감수성 시험이 요구된다.

반코마이신 내성 #

반코마이신에 내성을 나타내는 장알균 빈도가 증가하면서 장알균은 반코마이신과 아미노글리코사이드에 대한 감수성 상승효과는 없다. 반코마이신 내성은 대부분 E. faecium에 흔하지만 E, faecalis에서도 내성은 일어난다. 반코마이신 내성형 중 VanA 형은 반코마이신과 테이코플라닌에 고도내성을 나타내고 VanB형은 반코마이신에 유도내성이나 테이코플라닌에 감수성이다. 반코마이신에 중등도 내성을 보이는 VanC는 E. gallinarum (VanC-1), E. casseliflavus (VanC-2/VanC-3)가 있다. VanD 형은 반코마이신에 중등도 내성, 테이코플라닌에는 저도 또는 감수성을 보인다. 테이코플라닌은 반코마이신과 유사성이 높은 글리코펩타이드 계열로 유럽에서는 환자 치료로 사용하나 미국에서는 사용하지 않는다. 반코마이신과 테이코플라닌은 펩티드글리칸 전구체의 pentapeptide의 D-alanyl-D-alanine (D-Ala-D-Ala) 그룹과 결합함으로서 그람양성세균의 세포벽 합성을 억제한다. vanA, vanB vanD는 D-Ala-D-Lac을 암호화하고 반면 vanC와 vanD는 D-Ala-D-Ser을 암호화한다.

β-lactamase 생성과 β-lactams 내성 #

enterococcal β-lactamase을 암호화하는 유전자가 장알균에서는 구성적으로 발현되고 있으나 S. aureus에서는 유도적으로 발현되고 있다. 장알균은 소량을 생산하기 때문에 일상적인 감수성 시험에서 페니실린과 암피실린에 감수성으로 나타난다. 따라서 β-lactamase를 검출하려면 접종량을 많이 하거나 chromogenic cephalosporin 시험 등으로 검출하여야 한다. 겐타마아신 고도내성은 보통 β-lactamase 생산을 동반하고 이들 특성을 암호화하는 유전자는 conjugative plasmid에 있고 다른 장알균으로 전이가 가능하다.

Trimethoprim-sulfamethoxazol (TMP-SMZ) 내성 #

장알균은 보통 in vitro에서 TMP-SMZ에 감수성을 보이나 감염치료에는 효과적이지 않은데 이는 장알균이 생체내에서는 exogeneous folate을 이용하여 이들 약제의 억제를 피할 수 있기 때문이다.

항생제 감수성 검사 #

장알균 중 특히 VRE의 항생제 내성양상을 확인하기 위하여 글리코펩타이드계 항생제에 대해서는 최소억제농도 (MIC) 측정법을 실시하고, 페니실린계 등 기타 항생제에 대해서는 원판확산법으로 검사한다. 항생제 감수성 검사의 모든 과정은 Clinical and Laboratory Standards Institute/National Committee for Clinical Laboratory Standards (CLSI/NCCLS) 지침에 따라 수행한다 (감염병 실험실 검사 2003, http://pathogen.nih.go.kr 일반시험법 pp 191~216 참조).

반코마이신 내성 장알균 선별배양 #

장알균에서 반코마이신 내성이 증가하면서 VRE의 선별분리의 중요성이 증가하고 있으며 VRE 확산방지에는 VRE의 조기진단이 매우 중요하다. 대변이나 직장채변과 같은 검체에서 VRE 분리율을 증가시키기 위한 선별증균 배지로는 6 ㎍/㎖ 반코마이신을 첨가한 Enterococcosel broth (BE azide medium:Becton Dickinson Microbiology Systems, Cockeysville, Md.)를 많이 사용하고 있다. 증균 전후 분변검체로부터 VRE 분리는 supplemented Columbia colistin-nalidixic acid broth에서 증균 후 6 ug/㎖ 반코마이신이 포함된 Enterococcosel agar에서 배양하는 것이 좋다. 역학적 연구로 환경에서 VRE 분리가 필요한 경우에는 미리 축축하게 한 면봉으로 검체를 채취하여 증균배지나 한천배지에 접종하여 VRE를 분리한다. E. faecalis와 E. faecium에서 VanA와 VanB 내성은 내성유전자의 이동이 가능하고 고도내성을 나타내므로 실험실에서 VRE를 보고할 경우 의심되는 VRE 분리주의 정확한 진단이 중요하다.

반코마이신과 테이코플라닌 감수성 시험 #

반코마이신과 테이코플라닌을 각각 512 1 ㎍/㎖에서 512 ㎍/㎖까지의 농도로 2배 연속 희석하여 각 농도를 함유하는 Müller-Hinton agar (Bacto®, Difco)를 제조한다. 0.5 McFarland의 VRE균 부유액을 10배 희석 한 후 항생제 각 농도별 플레이트에 2 ㎕ 씩 접종한 후 35℃에서 24시간 배양 후 균 성장의 여부를 관찰하여 최소 억제 농도를 결정한다.

기타 항생제 내성 양상 #

장알균의 글리코펩타이드계 이외의 항생제에 대한 감수성을 조사하기 위하여 암피실린, 클로람페니콜, 시프로플로삭신, 에리스로마이신, 리팜핀, 테트라사이클린 등과 아미노글리코사이드 고도 내성을 확인하기 위하여 겐타마이신 (GM, 120 ㎍/㎖), 스트렙토마이신 (S, 300 ㎍/㎖) disc (BBL® Sensi Disc®)를 사용한다. VRE는 반코마이신에 대한 MIC, 내성 유전자형 종류 및 유도능에 따라 vanA, vanB, vanC, VanD, VanE 및 vanG 형으로 분류된다. vanC VRE 중 E. gallinarum은 vanC-1, E. casseliflavus는 vanC-2로 세분화된다.

VRE 유전자형 확인시험 #

반코마이신 내성 장알균의 vanA, vanB, vanC1, vanC2, vanD, vanE 등의 반코마이신 내성유전자형은 PCR 법으로 검출 확인한다. van 유전자 각각의 특징을 확인하기 위한 primer 제작은 GenBank의 M97297, AE016954, AF175293의 염기서열을 기초로 primer는 vanA (5’-atggcaagtcaggtgaagatgg, 3’-tccacctcgccaacaactaacg, 399 bp), vanB (5’-gatgcggaagataccgtggct, 3’-catcgccgtccccgaatttcaaa, 298 bp), vanD (5’-tgcagccaagtatccggtaa, 3’-taaggcgcttgcatataccg, 461 bp)를 사용한다.

참고문헌 #

  • 항생제 내성: 지난 50년간의 변화와 향후 전망 - 그람양성균, 송재훈
  • Antibiotic Susceptibility and Genetic Diversity of Enterococci Isolated from Clinical Specimens, CW. Lim, HL. Kim, YH. Kim
  • Status on sentinel surveillance system of multidrug-resistant organisms in Korea, JS. Lee
  • 감염병실험실진단Ⅱ -질환별시험법, 이주실
  • 질환백과, 서울아산병원
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