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Digital next generation sequencing #
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Experiment

Digital Sequencing이란? #

유전체 상에서 특정 부위만 보고자 할 때 Targeted sequencing을 이용하는 것이 매우 효율적인 방법이다. 그러나 target을 detection 것이 쉬운 일은 아니다. 예를 들어 인간유전체의 약5%를 차지하는 SNVs를 detection 하기 위해서는 높은 depth의 시퀀싱이 필요하다.

이렇게 낮은 비율로 존재하는 변이를 찾기 위해서 target enrichment 방법을 사용한다. NGS를 수행하기 전에 목적하는 부위를 증폭시켜서 타겟부위의 양을 늘려놓은 방법이다. 일반적으로 PCR-based enrichment 방법이 사용된다. 이 방법을 이용하면 작은 DNA양으로도 특정 부위를 시퀀싱 할 수 있다. 하지만 PCR-based enrichment 방법은 RCR amplification bias와 artifacts를 유발한다는 단점이 있는데, 이로 인해서 quantification accuracy가 떨어지게 된다. 왜냐하면, 증폭과정에 의해 증폭된 부위인지 원래 transcript인지 알 수 없으므로 변이를 발견했을 때, 이 변이가 드물게 나타나는 변이 인지 아닌지를 구분할 수 없다.

PCR 증폭으로 인한 bias 문제를 해결하기 위해서 개발된 것이 Digital next generation sequencing (이하, Digital Sequencing)방법이다. 아래는 Digital sequencing을 적용한 QIAseq Targeted DNA Panel의 워크플로우이다

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QIAseq Targeted DNA Panel 워크플로우 출처: http://biomarkerinsights.qiagen.com/2016/08/31/what-is-digital-next-generation-sequencing-technology/

이처럼 증폭과정 전에 “Unique molecular index (UMI)”라고 하는 유니크한 램덤서열(12bp)을 각각의 target DNA molecule에 달아준다. 이곳을 보면 UMI와 digital sequencing에 대해 잘 설명되어 있다.

그러면 read들을 아래와 같은 기준으로 구분할 수 있게 된다.

  1. 같은 UMI를 가지고 있는 reads: 같은 original molecule로 부터 증폭된 reads
  2. 다른 UMI를 가지고 있는 reads: 서로 다른 original molecule로 부터 증폭된 reads

그러므로 특정 read에서 변이가 있을 때 이것이 sequencing/PCR error인지 original DNA가 실제로 변이를 가지고 있는지를 판단할 수 있다.

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Digital DNA-seq Technology: Targeted Enrichment for Cancer Research 출처: shareslide @QIAGEN

그러나, 이 과정 중 아래와 같은 에러들을 고려해야 한다.

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Potential Errors in UMIs 출처: https://hemberg-lab.github.io/scRNA.seq.course/unique-molecular-identifiers-umis.html

UMI-aware variant caller #

그렇다면 Digital Sequencing으로 생성된 read들은 일반적인 read와 달리 특정한 서열 UMI를 가지게 되는데 이는 variant calling 시에도 UMI를 인식해서 처리할 수 있는 UMI-aware variant celler (barcode-aware variant caller)가 필요하다. 대표적으로 QIAseq targeted DNA panel에서도 사용하고 있는 “smCouner (https://github.com/xuchang116/smCounter)”가 있다. smCounter는 MT(=UMI)정보를 이용해서 true variant인지 아닌지를 구분한다.

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