DGGE #

DGGE란 Denaturing Gradient Gel Electrophoresis의 준말이며, 분자생태학적 방법의 하나로써 복합 미생물군집의 유전적 다양성을 규명하거나 유전자 변이의 검출과 같은 DNA 다형성을 해석할 수 있습니다.
이 기법은 dsDNA 절편이 보유한 고유 염기서열의 melting temperature에 의해 dsDNA 일부가 해리되면서 발생하는 물리적 형태의 변형에 따라 Denaturing Gradient Gel 내에서 DNA 이동속도가 변화하는 것을 원리로 합니다. 따라서 같은 분자량의 DNA라고 하여도 각각의 고유한 염기서열의 Tm value에 따라서 gel 상에서는 다른 위치의 band로 나타납니다.

DGGE 원리 #

DGGE pattern 분석법의 원리는 전기영동시 gel내에 존재하는 denaturant(변성제)의 농도 구배에 따른 핵산의 이중나선 구조와 변성구조, 즉 염기서열이 가지는 Tm 값의 차이에 의해 핵산의 이동속도가 달라지는 점을 이용한 것입니다 (Lerman et al., 1984).

PCR의 주형으로 이용되어지는 다양한 환경 DNA에 의해 생산되어진 동일한 크기의 PCR 산물을 denaturing gradient gel에서 전기영동을 하면 시료가 이동되면서 각각 다른 농도의 Urea와 formamide에 노출되어 이중나선의 DNA가 단일가닥으로 전환되어집니다. 이렇게 전환되어지는 비율은 염기서열내에 존재하는 melting domain에 따라 달라지게 되며 gel상의 특정 위치에서 특정염기서열을 가진 DNA가 band 형태로 나타나게 됩니다.

따라서 낮은 농도의 denaturant를 가지는 gel 상단에서는 낮은 Tm 값을 가진 DNA가 검출되어지며, 높은 농도의 denaturant를 가지는 하단의 gel에서는 높은 Tm 값을 가진 DNA가 검출되게 됩니다. 이 때 서로 다른 염기서열을 가진 DNA가 각기 다른 위치에서 band를 형성하므로 염기서열의 n값이 증가할 수록 band의 수는 늘어나게 되고 동일한 염기서열이 많아질수록 나타나는 band의 명도가 증가하게 됩니다.

그러므로 전체적인 DNA에 대한 수적 그리고 양적 변화를 하나의 gel상에서 관찰할 수 있는 장점이 있습니다. 또한 DGGE pattern 상의 band로부터 직접 DNA를 회수한 후 염기서열을 확인할 수 있는 장점을 가지기 때문에 Cloning을 통한 염기서열분석에 대한 시간 및 경제적 손실을 최소화할 수 있습니다.

이렇게 미생물 군집의 정성적 분석이 가능한 장점도 있지만, 낮은 분포를 보이는 군집의 경우 증폭산물이 적기 때문에 ethidium bromide에 의해 염색이 안되어 검출되지 않을 수도 있습니다. 또한 DGGE 방법의 경우 gradient gel을 만드는 과정이 복잡하고 GC clamp를 가진 Primer를 합성해야하는 실험 절차상 문제점도 존재하며, PCR 반응시 GC clamp에 의한 Mismatch 그리고 DNA 증폭과정 또는 분석과정시 합성될 수 있는 heteroduplex에 의한 오류를 고려해야만 합니다.

DGGE 실험 방법 #

1. Variable Enviromental Sampling

2. Total DNA Extraction

3. Electrophoresis (23kb Total DNA band)

4. DNA/Protein analysis

5. PCR for DGGE

6. Electrophoresis(167bp band)

7. PCR product concentration

8. DGGE gel casting

9. DGGE running

DGGE 실험 방법 상세 #

1. 프라이머 디자인: GC clamp는 일반적으로 가장 분열하기 쉬운 곳에 인접하도록, 또 증폭한 100~400bps의 배열 중에 분열하는 곳이 적어도 1개, 많아도 2개의 영역이 되도록 설계합니다.

2. 농도구배젤 만들기: 적당한 변성제 농도의 Gradient Gel을 만듭니다. 이 때, 전기영동의 진행방향을 향해 변성제 농도가 높아지도록 합니다. 일정한 온도의 TAE에서 15분정도 pre-run을 수행합니다.

3. 전기영동: 샘플을 로딩 후, 일정 전압으로 수행합니다. 분리능을 높이기 위해, 저전압(50~60V정도)으로 하룻밤 영동하는 경우가 많습니다.

4. 염색: EtBr뿐만 아니라, 더욱 감도 높은 SYBR Gold나 SYBR Green와 같은 염색물질을 이용해 DNA를 염색합니다.

5. 밴드 잘라내기: 매우 밀집하여 얇은 밴드가 되는 경우가 많기 때문에, 멸균시킨 파스퇴르 피펫이나 피펫팁가 이용되는 경우가 많습니다. 잘려나온 젤에서 TAE버퍼 등으로 DNA를 용출하여 PCR을 수행 후, 시퀀싱에 이용합니다. 밴드가 충분히 분리되는 것을 기대할 수 없는 경우에는, TA 클로닝 등을 병용합니다.

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