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Cloning #
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Experiment

Cloning #

클로닝을 쉽고 간단하게 말하자면 한 개체와 동일한 다른 개체를 만드는 방법을 일컫는다. 특정한 DNA 조각을 플라스미드인 벡터(Vector)에 삽입시킨 후, 숙주로 다시 넣는 것을 의미한다.

벡터 내 유전자 삽입 방법 #

제한효소를 이용한 방법 #

유전자는 어떻게 벡터 내로 삽입되는지 알아보도록 하자. 유전자가 있는 DNA와 플라스미드를 동일한 제한효소로 잘라 벡터와 삽입 DNA가 일치하는 말단을 가지고 있어야 한다. DNA ligase(리가아제)를 통해 벡터와 삽입 DNA가 연결되게끔 한다. 벡터는 다중 클로닝 자리(multiple cloning site,MCS) 또는 폴리링커(polylinker)라고 하는 여러 개의 제한효소를 가지고 있어야 하며, 이는 클로닝 시 제한효소를 선택할 수 있고, DNA 삽입이 플라스미드에 손상을 주지 않는다. 각각의 제한효소 자리는 특정한 제한효소만을 인식하기 때문이다. 그리고 다중 클로닝 자리에 있는 제한효소 1이 플라스미드의 다른 곳에는 없어야 한다.

Gibson's assambly #

Daniel G. Gibson에 의해 만들어진 방법으로 여러 DNA 조각을 한 번의 반응으로 연결하는 클로닝 기법이다. 이 방법은 사전에 PCR로 DNA 조각을 증폭시키는 과정에서 forward, reverse primer에 Vector에 존재하는 어떤 서열 A를 임의로 같이 포함해 증폭시키고, Vector에는 서열 A 안에 존재하는 제한효소 자리를 제한효소로 잘라 서열 A가 각 끝에 노출되게 준비한다. 그리고 서열 A를 공유하는 DNA fragment와 vector가 서로 상보적으로 결합하게 하고 DNA ligase로 gap을 메꾸면 된다.
이 방법은 DNA 조각을 하나만 삽입하는 것이 아닌 한번에 15개까지 동시다발적으로 연결할 수 있고, 여러 DNA 조각들이 단 한 번의 과정으로 결합하기 때문에 매우 유용하다.

Workflow #

구체적인 과정은 다음과 같다.

  1. 연결하고자 하는 vector와 DNA 조각을 사전에 준비한다. 이때 vector는 DNA 조각을 삽입할 자리를 제한효소로 처리하여 벌어지게 하고, DNA 조각은 PCR로 증폭시키면서 조각의 양 끝에 Vector와 같이 공유하는 짧은 서열 (20~40bp)을 덧붙인다.
  2. 준비된 vector와 DNA 조각을 exonuclease, DNA polymerase, DNA ligase 이 세 가지 enzyme cocktail과 섞고 50℃에서 1시간 반응시킨다.
  3. 이 과정에서 exonuclease가 각 DNA의 5’ 말단을 제거하고, 3’ overhang이 생기게 된다.
  4. Vector와 DNA 조각의 3’ overhang은 서로 상보적인 서열을 가지고 있어 달라붙게 된다.
  5. 이어진 조각 사이의 gap을 DNA polymerase와 DNA ligase가 메꾸고 연결하면 목적했던 DNA가 탄생한다.

만약 기본 vector에 여러 개의 DNA 조각들을 한꺼번에 연결하고 싶다면, DNA 조각 A, B, C를 PCR 할 때 옆에 연결하고 싶은 DNA 조각의 서열 끝 부분을 포함하면 된다.

즉, vector – A – B - C - vector 순으로 조합시키고 싶다면 다음과 같이 DNA 조각들을 준비하면 된다.
DNA 조각 A를 증폭시킬 때, 한쪽 끝에는 vector의 서열을 다른 쪽 끝에는 DNA 조각 B의 서열을 덧붙인다.
DNA 조각 B는 한쪽에는 DNA 조각 A의 서열을, 다른 쪽에는 DNA 조각 C의 서열을 덧붙인다.
DNA 조각 C는 한쪽에는 DNA 조각 B의 서열을, 다른 쪽에는 vector의 서열을 덧붙인다.

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