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항생제 내성 동향 - AMR 스크리닝 방법 #
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Biology
  • F Anjum(2015) 와 R Schmierder & R Edwards(2012) 논문을 리뷰한 내용입니다.

항생제 내성 문제 대두 #

항생제 내성(antimicrobial resistance - AMR)은 21세기의 문제로 꾸준히 대두되고 있다. 항생제의 과용 및 오남용으로 인해 항생제 내성 박테리아가 널리 퍼지고 있으며 이에 따라, 전 세계적으로 사람과 동물 모두에 세균성 감염 처치에 영향을 미치고 있다. 최근 영국의 AMR에 위탁된 의장 Jim O'Neile의 보고서에 의하면 AMR은 가까운 시일 내에 기후 변화보다 더 위협이 될 것이라고 한다. 박테리아의 AMR은 염색체 유전자의 돌연변이 뿐만 아니라 AMR에 연관된 유전자를 가지고 있는 mobile element 를 획득함으로써도 가질 수 있다. 따라서 AMR에 대한 대책을 수립하기 위해서는 AMR에 대한 동정이 선행되어야 한다.

항생제 내성 기작 #

항생제 내성기작은 아래와 같이 크게 네 가지로 구분된다.

  1. 항생제를 변화시키거나 비활성화하는 방법
  2. 항생제의 타겟 사이트를 변형시켜 항생제의 결착력을 저하 시키는 방법
  3. 세균 내 대사 경로를 변화시켜 항생제의 영향을 피하는 방법
  4. 항생제의 내부 유입을 저하하거나, 외부 유출 펌프 (efflux pump)활성화하는 방법

박테리아는 유전자의 돌연변이를 통해 항생제 내성을 획득하거나 (vertical evolution) transposon 혹은 plasmid 등의 mobile genetic element를 박테리아 간에 공유하면서 항생제 내성을 획득 (horizontal gene transfer) 하기도 한다.

  • 항생제 내성 메카니즘

항생제내성메카니즘

출처: Wikipedia

  • Horizontal gene transfer 메카니즘

HGT

출처: StackExchange (Biology)

AMR 스크리닝 방법 #

이러한 AMR 스크리닝 방법은 크게 표현형에 대한 접근법과 유전자형에 대한 접근법 두 가지로 나눌 수 있다.

표현형 접근 방법 #

표현형을 기반으로 한 AMR 스크리닝은 보통 nonselective 나 antibiotic selective 된 한천배지에 샘플을 도포 하고 콜로니를 정제한 뒤 디스크 확산, gradient strip 등의 방법을 이용하여 MIC (Minimum inhibitory concentration) 값을 결정하는 방법으로 진행된다. MIC 란 최소억제농도를 뜻하는데, 박테리아가 특정 항생제의 농도를 기준으로 내성 또는 감수성을 가지는지를 평가하는 데 사용되는 수치를 뜻한다.
이러한 접근 방법은 가장 유용한 정보를 제공함에는 분명하지만, 박테리아를 배양하고 콜로니를 정제하는 데에 많은 시간이 소요된다.
이러한 스크리닝 방법을 자동화 한 시스템에는 Vitek(bioMerieux, USA)나 MicroScan(Siemens Healthcare Diagnostics Ltd, UK) 등이 있으며 항생제 내성에 대한 high throughput 데이터를 제공하고 sensitive 한 결과를 확인할 수 있지만, 전 과정에 약 12시간 정도가 소요되며, 이 시간은 항생제 내성을 지닌 박테리아가 MDR(multi drug resistance) 를 가지게 될 수도 있는 충분한 시간이다. 또한, 이러한 표현형에 대한 접근 방법은 임상에서 사용할 수 있는 박테리아의 내성 여부와 어느 정도의 내성을 가지느냐에 대한 수치적 판단만을 확인할 수 있으며 박테리아가 내성을 가지게 되는 기작 등에 대한 상세한 정보를 전달하기에는 어려움이 있다. 이러한 상세한 정보를 전달하기 위해 유전자형을 기반으로 하는 접근 방식을 시도하게 되었다.

유전자형 접근 방법 #


최근 AMR 동정을 위해 다양한 PCR 기법 (Real-time PCR, Multiplex PCR 등)이 사용되고 있으며, 이러한 분자생물학을 기반에 둔 기법들은 AMR 유전자의 빠른 진단이 가능하도록 했다. 예를 들면, LAMP (Loop-mediated isohtermal amplification) assay는 30분 이내에 동정 결과를 확인할 수 있다.
또한, NGS (Next generation sequencing) 기법이 도입된 이래로 더더욱 빠르게 AMR 유전자들을 특정할 수 있게 되었다. NGS 기법을 이용하여 박테리아의 WGS(Whole genome sequencing)을 통해 AMR 유전자데이터베이스(CARD, ARDB 등)와 BLAST 등의 분석툴을 이용하여 서열 간 상동성 비교를 통해 박테리아에 현존하는 AMR 유전자를 정의한다. 또한, 이렇게 항생제 내성을 가지는 박테리아들의 WGS를 통한 AMR 유전자를 예측하는 연구들이 점점 늘어나는 추세이다.
그러나 이러한 서열 정보를 기반으로 하는 접근 방법은 이미 알려진 AMR을 정의하는 데에는 용이하지만, 돌연변이, integron 등에 따른 새로운 기작에 의한 항생제 내성이나 새로운 AMR 유전자를 찾아내는 데 적용은 어렵다.
예를 들면 Klebsiella pnuenomiae 의 carbapenem 내성 유전자는 표현형 기법에 의해 발견된 후 유전자형으로 특정되었다. 최근에는 생명공학 기법을 적용하여 특정 토양이나 슬러지 등의 미생물로부터 DNA를 추출하여 다른 종의 vector에 삽입 후 숙주로 성장시킨다. 이렇게 형질전환 된 숙주를 특정 항생제 내성을 스크리닝한 뒤 AMR 유전자를 정의하는 방법도 많이 사용되고 있다. 이 접근 방법은 알려지지 않은 알려진 AMR 유전자뿐만 아니라, 새로운 AMR 유전자를 밝혀낼 수도 있는 방법으로 여겨지고 있다.

메타지노믹스 기법 적용 #

Hugenholts 등(1998)은 미생물들이 실험실의 배양 배지에서 배양된 경우 미생물의 다양성이나 항생제의 활성화 혹은 항생제 내성 유전자 등을 잃어버리는 경우가 발생한다는 연구결과를 발표했다. 이러한 이유로 별도의 배양과정 없이 바로 미생물 유전체 연구를 수행할 수 있는 메타지노믹스 기법이 항생물질이나 항생제 내성연구를 위한 하나의 대안적인 선택지로 각광받고 있다(Castro 등 (2014)). 메타지노믹스 기법은 Chlamydia 등과 같이 host 외부환경에서 배양이 어려운 박테리아나 알려지지 않은 새로운 항생제 내성과 관련된 유전자를 발굴하는 연구에 유용하게 사용되고 있다. 특히 NGS 기술과 결합되어 메타지노믹스는 환경 미생물이나 의학 미생물의 미생물군집 연구에 강력한 도구가 되고 있다.

체내 미생물 군집의 항생제 내성 #

최근 미국 등에서 HMP (Human Microbiome Project), MetaHIT (Megenomics of the Human Intestinal Tract) 등의 거대한 체내 미생물 연구프로젝트가 활성화되었고, 이중 항생제 내성에 관한 연구들도 활발히 이루어졌다. Sommer 등(2009)은 장기간(1년 이상) 항생제 처리를 받지 않은 사람들의 체내 미생물의 기능적 측면의 메타지노믹스 기법을 도입하여 추출된 DNA를 cloning 하여 13종류의 항생제를 처리를 실시했다. 이중 상당수의 클론이 항생제 내성을 가지는 것으로 확인되었다. 이러한 미생물의 공생관계는 새로운 항생제 내성을 가지는 박테리아 strain 발생의 가능성을 내포하고 있다. Seville 등은 3개월 이상 항생제를 처방하지 않은 경우에도 구강이나 변의 메타지노믹 데이터에서 항생제 내성 유전자가 발견되는 것을 확인하였다. 이는 항생제는 체내 미생물에 오랜 기간 영향을 미치며 반복적인 항생제 섭취 등은 미생물의 군집을 완전히 변하게 하는 원인이 될 수 있음을 시사한다.

토양 내 미생물 군집의 항생제 내성 #

토양은 항생 물질이 합성되는 가장 대표적인 생태계이며 현재 의학적으로 사용되는 항생제의 80% 이상이 토양 미생물로부터 발견되었다. 바꿔말하면 이런 미생물들은 항생제 내성을 획득하게 되는 요인이 될 수 있다. 토양 미생물의 메타지노믹 연구는 서로 다른 토양샘플들로 부터 채취된 미생물들의 다양한 내성 기작을 보여준다. 예를 들면 Allen 등(2010)의 연구에 의하면 항생제 유입이 전혀 없던 Alasakan 토양에서 beta-lactam에 내성을 가지는 유전자를 발견했다. 또한, Torres-Corte(2011) 등은 trimethoprim에 내성을 가지는 reductase 타입의 새로운 유형의 유전자를 발견했다는 연구를 발표했다.

폐수 내 미생물 군집의 항생제 내성 #

폐수처리장은 다양한 환경들의 접점으로 서로 다른 미생물 종류의 사이에 (병원체, 기회감염균 혹은 환경 박테리아 등) mobile element 가 서로 교환될 수 있는 기회의 장이다. 활성슬러지에서의 항생제 내성 정도는 지금까지의 연구들로는 명확하게 결론지어지지 않았다. 활성 슬러지내의 메타지노믹스를 이용한 몇몇 연구를 통해 항생제 내성 요인을 발견하였으나 클로닝 등을 통한 기능적인 측면에서 항생제 내성을 지니는 클론은 아직 확보되지 못했으며, 서열 기반을 통한 분석을 통해 알려진 내성 유전자가 발견되었을 뿐이다. Schlüter 등 (2008)의 또 다른 오물에 대한 연구에 의하면 매우 다양한 플라스미드와 내성 유전자가 발견되었으며 특히 beta-lactamase family 유전자와 유사도를 가지는 유전자가 많이 발견되었으며 이 유전자들의 모티프는 특히 이는 병원 내 환자의 병원체에서 발견된 유전자들의 모티프와 유사성을 보였다.

동물, 농업에서 의 항생제 내성 #

동물 농장 등의 농업에서 사용되는 항생제는 여러 가지 의견이 있다. 농가에서 사용되는 항생제남용의 가장 큰 문제는 농가에서 생산되는 가축뿐만 아니라 농가 주변 환경의 미생물에 영향을 미칠 수도 있다는 점이다. Kazimierczak 등 (2009), Bager 등 (1997), 그리고 Hammerum 등(2000) 등의 연구에 의하면 농장에서 사용되는 항생제가 새로운 strain을 퍼트리는 역할을 할 수 있다는 연구를 발표했다. 예를 들면 항생제에 노출된 가축과 그 가축에 접촉한 사람 혹은 항생제에 노출되지 않은 가축 모두에 vancomycin-resistance enterococcus 종이 발견된 것이다.

한계 #

메타지노믹스는 다양한 연구에 활용되지만, 한계점 또한 존재한다. 기능 중심의 메타지노믹스의 연구를 수행하는 경우, 클로닝 시 insert fragment 길이나 실험의 환경적 요소 때문에 정확한 연구가 이루어 지지 않을 수 있다. 특히 항생제 내성 유전자는 다양한 유전자들에 의해 조절되기 때문에 다양한 각도에서 실험을 설계해야 한다.
서열 기반의 메타지노믹스 연구에서는 많은 수의 서열들이 기존의 서열과 유의미한 유사성을 기준으로 스크리닝하는 데 어려움이 있다. 새롭게 밝혀진 유전자룰 보면 기존에 밝혀진 유전자들과 비슷한 기능을 가지지만 전혀 다른 서열을 가지는 경우도 상당 부분 보고되고 있다.

결론 #

AMR을 탐지하기 위한 다양한 방법들이 개발되고 있고, 이러한 방법들은 여전히 AMR을 탐색하는데 장단점을 가지고 있다. 최근 빠른 속도나 많은 양의 정보를 얻기 위해서 유전자형을 기반으로 하는 접근 방법으로 많이 틀어지는 추세이지만, 박테리아는 게놈의 다양성은 현재의 기술로는 예측이 어려우므로 표현형을 기반으로 한 접근방법 또한 배제하기는 어렵다. 따라서 AMR 탐지 방법들을 균형 있게 적용하여 다양한 경우의 수에 대한 박테리아 AMR 스크리닝을 수행하는 것이 중요하다.

참고 문헌 #

  1. M. F Anjum. 2015. Screening methods for the detection of antimicrobial resistance genes present in bacterial isolates and the microbiota. Future Microbiol.
  2. Castro * et al ., * (2014) Insights into novel antimicrobial compounds and antibiotic resistance genes from soil metagenomes. Frontiers in Microbiology
  3. Hugenholtz, P. * et al., * Studies on the emerging phylogenetic view of bacterial diversity. J. Bacteriol.
  4. Hammerum AM et al., 2000. Characterization of vancomycin-resistant and vancomycinsusceptible Enterococcus faecium isolates from humans, chickens and pigs by RiboPrinting and pulsed-field gel electrophoresis. J. Antimicrob. Chemother.
  5. Kazimierczak KA et al., 2009. Tetracycline resistome of the organic pig gut. Appl. Environ. Microbiol.
  6. Bager F et al., 1997. Avoparcin used as a growth promoter is associated with the occurrence of vancomycinresistant Enterococcus faecium on Danish poultry and pig farms. Prev. Vet. Med.
  7. Schluter A et al., 2008. Genetic diversity and composition of a plasmid metagenome from a wastewater treatment plant. J. Biotechnol.

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