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항생제 내성 동향 - 균막(biofilm) 에 의한 항생제 내성 기작 #
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Biology

균막(biofilm)에 의한 항생제 내성 관련성 연구 #

균막 이란? #

biofilm

biofilm

그림 1. 균막(출처: bioninja)

박테리아 균막이란 이물질이나 생물이나 무생물의 표면에 세균들이 부착된 것으로 EPS라고 불리는 다당류, 단백질 및 유전자들을 포함한 세포 외 고분자물질 망에 부착된 경우도 많다. 이는 배양액 등에 떠다니는 planktonic 미생물과는 구분된다. 균막은 다음과 같은 과정을 통해 형성된다.

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그림 2. 균막 형성 과정(출처: tandfonline)

  1. 미생물이 생존하는 미생물/생물 표면에 부착된다.
  2. 부착된 표면에서 미생물이 성장하고, 세포 외 고분자물질을 구성하는 EPS(exopolysaccharide) 생성하며 미생물의 콜로니들이 다층으로 쌓인다.
  3. 일부 세포가 분리되어 다른 환경에서 새로운 균막을 형성한다.

이렇게 형성된 균막 내 미생물은 planktonic 미생물보다 항생제에 대한 내성이 100배에서 1,000배 증가할 수 있으며, 다양한 메커니즘에 의해 균막 내 높은 미생물들이 높은 수준의 내성을 가지게 된다.

균막에 의한 항생제 내성 기작 #

균막 형성에 의한 항생제 내성 획득 기작은 다음과 같다. https://www.tandfonline.com 첫 번째는 항생제가 균막을 투과하지 못해 항생제가 균막 내의 세균에 영향을 미치지 못하기 때문이다. 이는 세포 외 기질이 가지는 전하에 의한 것으로 음전하를 띄는 균막 매트릭스에 양전하를 띄는 항생제들이 결합하여 항생제가 균막을 투과하기 어렵게 된다.

두 번째는 균막에 의해 미생물이 충분한 영양소와 산소를 공급받지 못해 미생물의 생장에 영향을 미치면서 생기는 내성기작이다. 일반적으로 미생물 생장률이 낮아지면 항생제 내성을 높아지는 것으로 알려져 있다. 산소와 영양소는 미생물 성장에 큰 영향을 미치는 요소이다. 균막 내의 미생물은 균막에 의해 영양소와 산소 공급 등이 제한되면서 대체로 낮은 대사 활동과 낮은 성장률을 가지며 이는 저항성을 높이는 역할을 한다. 예를 들면, 균막 내 산소 부족에 의해 유출 펌프 활성 정도 및 에너지 대사의 저하로 인한 외부 항생제 내부 유입을 감소시키는 역할을 하여 항생제 내성을 높이는 역할을 한다.

세 번째는 퀴럼센싱(Quorum-sensing) 에 의한 유전자 발현 조절이다. 균막 내 미생물들이 각 미생물이 분비하는 신호물질을 인지하고 신호물질의 농도가 일정 수준에 이르면 해당 신호물질에 의해 유도되는 특정 유전자가 발현되는 것을 뜻한다. 균막 내 서로 다른 미생물 군집 간 생리학적 차이와 항생제 내성 기작들이 신호물질로 상호 간에 영향을 미치기 때문으로 추정된다.

항생제 감수성 실험 방법 #

균막과 항생제내성의 연관관계가 있다는 Lewis (2001) 등의 연구가 발표된 이래로 연구진들은 균막에 의한 항생제내성의 상관관계를 밝히고자 꾸준히 연구를 진행하고 있다. planktonic cell 과는 달리 균막에 대한 항생제 감수성 테스트는 우선 균막을 생성하도록 분리된 균주들의 배양을 선행해야 한다. 이렇게 생성도 생성된 균막을 항생제에 노출 시킨 뒤 균막의 biomass 등을 harvest 하여 노출된 항생제 농도 등에 대해 wild-type 과 mutant 의 콜로니 생성 수를 상호 비교 하여 감수성을 평가한다.

배양 방법 #

배양방법은 크게 closed system, open system 두 가지로 분류된다. closed system 은 복잡하지 않고 high-throughput 분석 수행에 용이하다. 대표적으로 Microtitre plate method, Calgary biofilm device 등이 있다.
open system 은 환경 및 영양소의 주입 방법 (flow, delivery) 등이 조절 가능하다. 대표적으로 flow cell, suspended subsratum reactor 등이 있다. 현재까지 균막을 위한 배양에 대한 표준화된 방법론은 정립되지 않았지만, 여러 연구진의 노력으로 P. aeruginosa 종에 한해 2013년 ASTM에서 승인된 방법론이 정립되기도 했다.

균막의 항생제 내성 검증 파라미터 #

항생제에 노출된 균막의 항생제 내성 정도는 다음과 같은 수치들로 판별된다.

파라미터명 설명
MIC Minimum inhibitory concentration
MBIC Minimum biofilm inhibitory concentration
BBC Biofilm bactericidal concentration
MBEC Minimal biofilm-eradication concentration
BPC Biofilm prevention concentration

생물정보학적 접근 #

지난 수 십년간 균막에 의한 항생제 내성 매카니즘을 밝히기 위해 metagenomics, RNA-Seq 등의 서열 데이터를 기반으로 한 연구들이 시도되고 있다.

Brazelton 와 Baross(2009)는 열수 침니 에서 유래된 균막에서 유래된 메타지놈 데이터를 이용한 분석을 수행하였다. 이 분석에서 사용된 메타지놈 데이터에서 transposon 서열 중 B-lactamase 내성 유전자와 관련된 서열이 많이 발견되었으며 (약 8.1%) 열수 미생물 군집에서 유래된 균막에서도 비슷한 양상을 보였다. 또한, 최근 연구에 의하면 Richimond 광산에서 채취된 메타지놈 데이터에서도 산성 광산 배수 균막에서 B-lactamase 내성 유전자 서열이 높은 비율로 발견하였다. 또 다른 연구에서는 MG-RAST 데이터베이스에서 공개된 메타지놈 데이터를 이용하여 environmental biofilm 에서 mobile genetic elements(MGEs) 와 항생제 내성 유전자(ARGs) 의 확산에 대한 비교분석을 수행했다. 강물과 하수처리장에서 발견된 데이터를 비교하였을 때 하수처리장에서 유래된 균 막의 서열에서 MGEs 관련 서열들이 더 많이 발견되는 것을 확인하였다. 또한, B-lactamase 내성 유전자, tetracycline 내성 유전자 서열 또한 비슷한 양상을 나타내는 것을 밝혀냈다.

Castro 등 (2017) 항생제 내성을 가지는 G. vaginalis 종의 RNA 시퀀싱을 통해 전사체 수준에서의 plnaktonic cell 과 균막 cell의 유전자 발현양상을 비교분석 하였다. 분석 결과 균막 세포에서 항생제 내성 관련 유전자의 발현이 증가하였으며, glucose 등의 대사에 관여하는 유전자들의 발현이 감소하는 양상을 보였다고 발표했다. Yoon 등 (2015)은 A. baumanni 종에서 항생제 내성에 관여하는 것으로 알려진 Resistance-Nodulation-Cell Division (RND) 유출 시스템이 항생제 내성과 균막 형성에 관여하는지를 밝히기 위해 전사체 및 단백체 수준에서의 분석을 수행했다. 이 연구에서 RND 유출 시스템에 관여되는 AdeABC와 AdeFGH가 과잉 생산 되는 경우 항생제 내성을 가지게 되는 양상을 보였으며 AdeABC 와 AdeIJK가 과잉생산 되는 경우 세포질 조성을 변화시키고 생물막 형성을 감소시킨다고 밝혔다.

또한, 균막에 의한 항생제 내성을 줄이기 위해 균막 생성 억제를 위한 연구도 활발히 진행되고 있다.

Qin 등(2014) 은 methichilline-resistance Staphylococcus aureus (MRSA) 에 의해 생성된 균막에 ursolic acid 와 resverarol 처리 후 RNA-Seq 을 통해 전사체 수준에서 유전자 발현 양상을 분석했다. 분석결과 ursolic acid를 처리한 경우 균막 형성에 관여하는 유전자들의 발현이 감소하는 패턴을 보이며 균막형성을 억제하는 양상을 보였고 resvertrol 이 quorum sensing 과 방해하고 polysaccharides 등의 합성을 억제하는 양상을 보였다고 밝혔다.

이렇듯 서열 기반의 데이터들이 항생제 내성 기작과 이를 해결하기 위한 방법을 탐색하기 위해 유용한 기법으로 사용되고 있다.

참고문헌 #

  1. Qi et al. 2016. Relationship between Antibiotic Resistance, Biofilm Formation, and Biofilm-Specific Resistance in Acinetobacter baumannii. Frontiers in Microbiology
  2. D. Hughes and D. I Anderson. 2017. Environmental and genetic modulation of the phenotypic expression of antibiotic resistance. FEMS Microbiligy Reviews.
  3. Sara M. Soto. 2012. Role of efflux pumps in the antibiotic resistance of bacteria embedded in a biofilm. Virulence.
  4. M. D. Macia et al. 2014. Antimicrobial susceptibility testing in biofilm-growing bacteria.
  5. Brazelton, W. J., and Baross, J. A. (2009). Abundant transposases encoded by the metagenome of a hydrothermal chimney biofilm.
  6. José L. Balcázar1 et al (2015) The role of biofilms as environmental reservoirs of antibiotic resistance.
  7. Eun-jeong Yoon et al (2015) Contribution of Resistance-Nodulation-Cell Division Efflux Systems to Antibiotic Resistance and Biofilm Formation in Acinetobacter baumannii.
  8. Joana Castro et al. (2017) Comparative transcriptomic analysis of Gardnerella vaginalis biofilms vs. planktonic cultures using RNA-seq.
  9. Nan Qin et al, (2014) RNA-Seq-based transcriptome analysis of methicillin-resistant Staphylococcus aureus biofilm inhibition by ursolic acid and resveratrol.

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