Primer #

그림1 The process and components of DNA replication

출처: https://www.benchling.com/wp-content/uploads/2020/08/DNA-replication-1024x376.png

Primer는 DNA합성의 시작점이 되는 짧은 유전자 서열로 PCR이나 DNA sequencing등에 이용할 목적으로 합성된 염기서열을 말한다. 주형가닥을 실험적으로 복제할때는 DNA중합효소와 더불어, 주형가닥에 상보적인 primer가 존재해야 복제과정이 진행된다. 많은 경우에 DNA 복제과정에 필요한 primer는 짧은 가닥의 RNA을 이용한다.

Primer 제작 #

Primer 제작시 유의점 #

1. 최대한 주형가닥에 맞는 Primer 제작
2. Mismatches/mispriming을 피해야 한다.

3. Primer-dimers의 형성을 피해야 한다.

4. 효율성의 극대화

5. Primer와 amplicon 간의 2차구조를 피해야한다.
6. non-specific product의 증폭을 피해야한다.

Primer 제작 가이드라인 #

• Primer길이 : 18~30 bp
• GC함량 : 30~80% (50~60% 가장이상적)
• Melting temperature : 50~65도
• 4개의 동일한 nucleotides은 반복적으로 제작하는 것은 피해야한다.
• Self-dimerization은 피해야 한다.
• Primer 3'말단에 상보적인 염기서열은 피해야한다.
• 3'말단에 5개의 base는 GC염기서열이 2개 이상은 피해야한다.
• 3'말단에는 T가 배치되는 것을 피해야한다.

Primer 제작 과정 #

1. 기존 문헌들의 primer을 활용한다.
2. 타겟 염기서열을 찾는다.
3. Primers를 제작
4. Primer 특성을 확인 (2차구조, Tm, complementarity)
5. Primer QC

Primer 제작에 활용가능한 DB 및 서비스 #

Primer DB #

• Real Time PCR pRIMER Sets (http://www.realtimeprimers.org)
• PrimerBank (http://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/index.html)
• RT Primer DB (http://medgen.ugent.be/rtprimerdb)
• Quantitative PCR primer Database (http://lpgws.nci.nih.gov/cgi-bin/PrimerViewer)

타겟 염기서열 확인 #

• Entrez Gene (NCBI)
• Ensembl Genome Browser (Sanger Institute, http://www.ensembl.org)
• Sequence Server (Dolan DNA Learning Center, http://www.dnalc.org/sequences)

Primer 제작 #

• Primer 3 (Whitehead Institute, MIT, http://frodo.wi.mit.edu)
• GeneFisher (Bielefeld University, http://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/genefisher2)
• Fast PCR (Biocenter, University of Helsinki, http://www.biocenter.helsinki.fi/bi/bare-1 html/oligo.htm)
• PerlPrimer (http://perlprimer.sourceforge.net)
• Primer Design Assistant (http://dbb.nhri.org.tw/primer)

Primer 특성 #

• OligoAnalyzer
• Oligo Analysis & Plotting Tool

Amplicon 2차 구조 평가 #

• mfold

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• Hot-start PCR
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• Primer3
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