유전체 편집 (Genome editing) #

유전자 편집 (또는 유전체 편집)이란 생물의 DNA를 변화시키는 여러 기술의 한 그룹을 의미한다. 이러한 기술들은 유전 물질들의 추가, 제거, 유전체 내 특정 위치에서의 변화를 진행하게 한다. 유전체 편집에 대한 몇 가지 접근법들이 개발됐다. CRISPR-Cas9의 출현 이전에, 두 가지의 접근법들이 DNA 내 위치-특정 이중나선을 절단하게 하는 데 사용되었다. 하나는 Zinc finger nucleases (ZFNs), 또 다른 것은 Transcription activoator-like effector nucleases (TALENs)이다. 이 기술들은 난도가 높고 시간이 오래 걸려 적용하는 데 어려움이 많았다. 하지만 쉽고 빠른 CRISPR-Cas9의 출현 이후 유전체 편집 기술은 다시 뜨거운 감자가 되었고 현재 수많은 연구자가 이 기술을 이용해 연구를 진행 중이다.

1세대 유전자 편집 기술 (Zinc Finger Nucleases, ZFNs) #

ZFNs는 DNA-결합 도메인들(서너 개의 특정 염기서열을 인식하고 결합함)로 구성되어 있는 단백질이다. 9개의 염기쌍 표적 서열에 있는 특수성을 주는 것은 나란히 융합된 세 개의 ZFN 도메인들을 요구할 것이다. DNA-결합 도메인의 원하는 배열은 또한 박테리아의 뉴클레이스 Fok1의 한 서브유닛을 암호화한 염기서열과 결합된다. 한 특정 부위에서 이중 결합의 절단을 가능토록 하는 것은 반대편 DNA 가닥에 있는 특정 위치의 각 면에 결합하는 두 ZFN 융합 단백질들의 설계를 요구한다. 두 ZFNs가 결합될 때, 근접해있는 Fok1 서브유닛은 두 가닥에서 표적 DNA를 절단하는 활동 타이머를 형성하기 위해 서로 결합한다.

2세대 유전자 편집 기술 (Transcription activator-like effector nuclease, TALEN) #

TALEN 융합 단백질들은 표적 위치 옆에 있는 특정 DNA 염기서열에 결합되도록 설계된다. 하지만, TALENs은 Zinc finger domains을 사용하는 대신에 한 식물병원체 그룹의 단백질로부터 파생되는 DNA-바인딩 도메인들을 이용한다. TALENs은 기술적으로 ZFNs보다 더 쉽게 제작된다. 특히, 더 긴 인식 위치에서 좋다. ZFNs과 비슷하게, TALENs은 설계된 DNA-바인딩 영역에 융합된 한 Fok1 도메인을 암호화한다. 그리하여 표적 위치가 두 면에 결합되면, 타이머 된 Fok1 뉴클레아제는 원하는 DNA 위치에 이중나선을 절단할 수 있도록 도와준다.

3세대 유전자 편집 기술 (유전자 가위) (CRISPR-Cas Systems) #

세균과 고세균은 CRISPR-Cas systems을 이용함으로써 외부 유전 물질들에 대항하여 적응적인 면역을 소유한다. 감염에 있어, 새로운 외부 DNA 염기서열은 새로운 스페이서로써 호스트 CRISPR 위치 안으로 포획되고 통합된다. 각 특이 스페이서 염기서열을 암호화함으로써, CRISPR 위치는 전사되고 성숙한 CRISPR RNAs을 발생시키려 진행한다. 각 crRNA는 crRNA 염기서열에 맞는 외부 유전 물질들을 잠재시키는 가이드로써 crRNAs를 사용하는 Cas 이펙터 단백질들과 연합한다.
CRISPR-Cas9 system은 과학계에서 거대한 관심을 불러 모았다. 왜냐하면 이는 존재하는 다른 유전자 편집기술들 보다 훨씬 더 빠르고, 더 저렴하고, 더 정확하며, 더 효율적인 기술이기 때문이다.

유전자 가위 CRISPR-Cas9 #

유전자 가위 CRISPR-Cas9의 기작 #

세균의 면역 CRISPR-Cas systems 3단계 1. 적응/기억 2. 성숙/조립 3. 방해/파괴

Credits: Linnea Holmström Ljung

The CRISPR-Cas9 가위

Credits: Linnea Holmström Ljung

CRISPR-Cas9은 모든 생물의 모든 유형의 세포들에서 유전자 편집 도구로서 사용된다.

Credits: Linnea Holmström Ljung

유전자 가위의 분류 (Classification) #

원핵생물의 CRISPR-Cas 면역 체계들은 이펙터 모듈 조직에 기반하여 두 가지 클래스로 나뉠 수 있다. Class 1 CRISPR-Cas 체계들은 다중단백질 이팩터 복합체를 이용한다. 반면에 Class 2 CRISPR-Cas 체계들은 단일단백질 이팩터를 사용한다. CRISPR-Cas 체계의 유전자 구성과 유전체 설계의 복잡성 때문에, 모든 분류 기준은 비현실적으로 만들어졌다. 그래서 Polythetic이라는 접근 방식(다원 발생, 비교 유전학, 구조 분석 등으로 결합된 증거들에 기반함)이 개발되었다. 두 개의 명확한 클래스에 기반하여, 더 나아가 6개의 주요 유형들로 나누어졌다. CRISPR-Cas 체계의 각 유형들 내에서 부가적인 시그니처 유전자들과 특정한 유전자 배치에 기반한 몇 가지의 하위 유형들이 기술돼왔다.

Class 1 CRISPR-Cas Systems #

Class 1 CRISPR-Cas Systems는 다중 소단위 crRNA-effector 복합체의 존재에 의해 정의되며, 3가지의 유형과 15가지의 하위유형으로 나뉜다. Class 1 systems은 CRISPR-Cas 발원지의 약 90%를 대표하고, 다양한 세균과 고세균 문(phylum)에서 발견된다. 이는 유형 1 (가장 공통적이고 다양화됨), 유형 3 (다양한 고세균에서 대표되나 세균에서는 흔치 않다) 그리고 희귀한 유형 4 (기본적인 CRISPR-Cas 발원지를 포함하고 적응 모듈이 결핍되어 있음)를 포함한다.

Class 2 CRISPR-Cas Systems #

Class 1 CRISPR-Cas Systems은 단일 소단위 crRNA-이팩터 모듈의 존재에 의해 정의된다. 그리고 3 유형과 18 하위유형으로 나뉜다. Class 2 이펙터 모듈은 단일의, 거대한, 다중도메인 단백질로 각각 구성된다. 그러한 개별적인 CRISPR-cas loci에서는 Class 1보다 훨씬 더 간단하고 더 많은 단일적인 조직들을 가진다. Class 2 systems는 CRISPR-Cas loci의 약 10%를 대변하며, 다양한 세균 문(phyla)에서 발견되나 고세균에서는 전무하다. 이펙터 단백질에 더하여, 대부분의 Class 2 유전체 loci에서는 적응 모듈 단백질, Cas1, Cas2, 그리고 보조 단백질들(cf. Cas4)을 암호화한다. 유형 2와 유형 5-B loci에서도 반복서열들과 부분적으로 상보적이고 CRISPR(cr)RNA 프로세싱과 인퍼런스에 포함되는 tracrRNA (trans-activating CRISPR RNA)을 포함한다. 그러나 어떤 Class 2 systems(특히 유형 5번)는 오로지 CRISPR 배치와 이팩터 단백질들로만 구성되어있기도 하다.

유전자 가위의 발전 #

CRISPR-Cas systems는 연구자들에게 인기 있는 분야일 뿐만 아니라 농업과 의학에서 괄목할만한 성과를 거두었다. CRISPR-Cas systems의 급격한 발전과 더불어, 그것의 잠재적인 적용 가치는 무궁무진하다. CRISPR-Cas systems의 다양성에 관한 학문에서의 진보는 새로운 이펙터 단백질과 locus architectures뿐 아니라 근본적으로 새로운 분자 메커니즘의 발견을 이끌었다. 이들은 유형 6 체계에 의해 배타적인 RNA-표적화를 포함한다. 유형 6 체계는 휴면 유도 또는 PCD와 함께 CRISPR 면역을 연결한다. 지속적인 과학기술의 발전으로, CRISPR-Cas systems는 끊임없이 향상될 것이다.

CRISPR-Cas9의 근황 #

최신 연구동향 #

Emmanuelle Charpentier Lab (CRISPR Cas9 최초 연구자)은 그램양성세균 인간병원체에 초점을 맞춰 감염과 면역의 과정에 있는 조절의 전반적인 메커니즘을 연구하고 있다. 이 연구실은 전사, 전사 후, 번역 후의 과정에서 어떻게 RNA와 단백질이 세포의 과정을 조절하는지에 대한 이해를 목표로 연구하고 있다.

Doudna Lab (CRISPR Cas9 최초 연구자)은 CRISPR-Cas 면역성에 기초하는 메커니즘을 명백히 밝히는 것에 관심을 두고 있다. 더 자세히 말하자면, Cas 단백질의 기능들을 이해하는 것과 새로운 CRISPR 기반의 도구들 (생명공학에서의 적용을 위해)이 Doudna Lab의 연구 방향이다.

특허 전쟁 U.C Berkeley vs Broad Institute #

-각 기관이 가지고 있는 특허의 차이점

미국에서 브로드가 출원한 특허들은 유전체 편집에 대한 것이고 그것은 진핵세포(동물, 식물, 인간)에서 사용된다.

UC 버클리가 출원한 특허들은 무세포 체계에서 진행된 연구에 기반한 것이다. 이는 진핵 세포 내 사용에 제한 없이, 표적 DNA 분자들을 변형하기 위한 방법들과 체계들을 포함한다.

-Broad Institute가 특허를 먼저 출원한 이유 (U.C 버클리가 먼저 신청했음에도 불구하고)

브로드와 UC버클리의 특허권은 각각 다른 발명들을 다룬다. 그렇기 때문에, 특허 출원의 순서 (또는 신청 날짜)는 중요하지 않다. 2012년 12월, 브로드는 특허 신청에 관한 조속한 심사를 요청을 대가로 70달러를 지불했다. 이는 USPTO가 특허 신청서를 더 빠르게 다루고 브로드도 더 빠르게 질의에 응답하는 데 동의한다는 것을 의미한다. 브로드의 8,697,359 특허는 2014년 4월에 발행되었다. (쾌속 심사를 한다고 해서 특허 신청서에 대한 정밀 조사를 단축하진 않는다.) UC버클리는 2012년 5월 특허 신청서에 쾌속심사를 신청하지 않았다. 2015년에 UC버클리는 USPTO에게 이의제기를 요청하여 오히려 3년의 불필요한 과정을 겪게 되었다. 그들의 특허신청은 2018년에까지 연기되었다.

위 내용은 Broadinstitute의 주장이다. 올바른 판단을 하기 위해서는 U.C 버클리의 입장도 들어보자.

국제 과학계는 수 많은 수상(the Breakthrough Prize in Life Science, Japan Prize, Gruber Prize in Genetics, BBVA Frontiers of Knowledge Award, and Kavli Prize in Nanoscience)을 통해 CRISPR-Cas9 유전체 편집에 대한 Doudna-Charpentier 팀에 의한 선구적인 발명을 널리 인정해왔다. UC버클리는 오랜 세월을 거쳐 인류 개선을 위한 특허출원된 기술들을 발전시키고 적용해왔다. 개방 정책과 일치하여, UC버클리는 비상업적이고 교육적인 그리고 연구 목적을 위해 이 기술을 사용하는 학술 기관들을 포함한 비영리 기관들의 CRISPR-Cas9 기술사용을 허락한다.

UC버클리는 Caribou Biosciences, Inc. of Berkeley의 독점적인 라이센스 (하위 라이센스 기업들을 포함하여)를 통한 CRISPR-Cas9의 폭 넓은 상업화를 장려한다. 추가적으로, Charpentier 또한 CRISPR Therapeutics AG와 ERS Genomics Limited.의 기업을 통해 이 기술의 라이센스를 보유하고 있다.

윤리문제 #

인간 유전체를 바꾸는 데 사용되는 유전자 편집 기술들은 윤리적으로 많은 논란이 되고 있다. 유전체 편집에 소개된 대부분은 생식세포보다는 체세포에 한정되어 있다. 이러한 변화들은 다음 세대로 물려주지 않는 특정 조직에만 영향을 미친다. 그러나 난자 또는 정자 세포에 있는 유전자들(또는 배아세포 유전자)에 만든 변화들은 다음 세대로 유전될 수 있다. 생식계열 세포와 배아 유전체 편집은 수많은 윤리적 문제를 일으킨다. 예를 들면, 이러한 기술을 이용하여 인간의 정상적인 특성 (키 또는 지능)을 강화하는 행위를 허용해야 할 수 있을지에 관한 문제이다. 윤리와 안전에 관한 우려들에 기반을 두어, 생식계열 세포와 배아 유전체 편집은 현재 많은 국가에서 불법으로 간주하고 있다.

참고자료 #

동영상자료 #

아래의 동영상은 CRISPR-Cas9의 메커니즘을 알기 쉽게 설명해 놓은 것이다. 분자 생물학은 눈에 보이지 않아 더 어렵게 느껴지는 경우가 많은데 동영상을 보며 이론적인 부분을 시각화하면 이해에 더 도움이 될 것이다.

출처 #

[출처 : http://doudnalab.org/research_areas/crispr-systems/ <
> https://www.sinobiological.com/types-of-crispr-cas-systems.html <
> https://ghr.nlm.nih.gov/primer/genomicresearch/genomeediting<
> https://www.britannica.com/science/gene-editing <
> https://www.broadinstitute.org/crispr/journalists-statement-and-background-crispr-patent-process <
> https://news.berkeley.edu/2019/06/25/patent-office-renews-dispute-over-patent-rights-to-crispr-cas9/]

참고 문헌 #

1. Makarova et al. An updated evolutionary classification of CRISPR–Cas systems. Nat Rev Microbiol. 2015 November ; 13(11): 722–736.
2. Koonin et al. Diversity, classification and evolution of CRISPR-Cas systems. Curr Opin Microbiol. 2017 June ; 37: 67–78.
3. Makarova and Koonin. Annotation and Classification of CRISPR-Cas Systems. Methods Mol Biol. 2015 ; 1311: 47–75.

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