배경 #

기존에 정립된 항생제 내성균 분석 방법들은 기본적으로 특정 항생제가 처리된 조건에서 균을 배양해 보거나 PCR로 항생제 내성 유전자를 확인하는, 분자생물학적 접근법을 기초로 한다. 이러한 방법들은 내성균의 항생제 감수성을 확인할 수 있고, 비교적 간편하고 빠르게 분석할 수 있다는 장점이 있다. 하지만 배양이 어려운 균의 경우 결과를 얻기 어렵다는 점과 타겟으로하는 유전자만 검사가 가능하다는 점, 그리고 그 유전자에 변이가 발생할 때 동정이 어려울 수 있다는 단점이 있다. 최근에는 NGS 기술을 이용하여 전체 유전체 서열을 직접 분석하여 항생제 내성균을 동정하려는 시도가 이루어지고 있다. 내성균의 전체 서열을 시퀀싱하여 동정할 경우 위에서 열거한 분자생물학적 분석법의 단점들을 극복할 수 있게 되지만 NGS 플랫폼의 데이터 생산량 대비 비용이 효율적이지 못하여 적극적으로 활용되지 못하고 있었으나, MiSeq과 Ion Torrent PGM과 같이 진단 목적의 소형 NGS 장비가 출시되어 이러한 단점이 극복되고 있으며 최근에는 MinION과 같이 실시간 시퀀싱이 가능한 휴대용 장비도 출시되어 기술적 장벽이 해소되어 가고 있다.

분석 방법 #

서열 기반의 항생제 내성균 분석은 크게 3가지 방향으로 진행된다.

항생제 내성균의 동정 #

첫 번째 접근은 16s rRNA 서열을 기반으로 항생제 내성균의 정확한 계통을 동정하기 위한 전통적인 계통 분석이다. 이를 위하여 Genbank의 미생물 서열 DB나 잘 정제된 미생물 서열 DB 등이 활용된다. 유사 서열 검색에 BLAST가 기본적으로 활용되기 때문에 방법적인 면에서의 차이는 크지 않지만 잘 알려진 바와 같이 GenBank의 경우 많은 서열이 등록되어 있지만, 동정 정보의 오류와 같이 정확성이 조금 떨어지고, 내성균의 추가적인 정보에 관한 필드들이 정제되어 있지 않아 추가 분석이 어렵다는 단점이 있고, 큐레이션된 DB의 경우 서열의 수는 적지만 배양이 확인된 정확한 서열 정보를 활용할 수 있다는 점과 발병지, 발병연도 등의 분석에 함께 고려할 정보들이 잘 정제되어 있다는 차이점이 있다.

항생제 내성 유전자의 동정 #

두 번째 접근은 항생제 내성 유전자 동정에 관한 접근이다. 기본적으로 BLAST를 이용하여 유사한 서열을 찾는 방법과 homology를 기반으로 한 예측 모델을 이용한다. 대표적으로 CARD(Comprehensive Antibiotic Resistance Database)나 ARDB(Antibiotic Resistance Genes Database)와 같은 항생제 내성 유전자 서열 데이터베이스가 있으며, 각 데이터베이스의 장점을 모아 별도의 새로운 참조 DB를 구축하여 사용하기도 한다.

변이 영역 발굴 #

세 번째 접근은 마커 탐색을 위한 분석이다. NGS 기반의 시퀀싱 비용 하락과 효율 향상에도 불구하고 잘 정립된 항생제 내성 유전자의 경우 PCR과 같은 전통적인 분자생물학적 방법들을 이용한 동정 기술의 장점과 수요도 존재하며, 이러한 기술들을 위한 특정 항생제 내성 유전자의 동정 및 특정 변이의 동정에 타겟이 되는 영역을 밝혀내는 분석이 필요하다.

동향 #

최근에는 NGS 기술 기반의 metagenomic 분석 방법으로 시퀀싱 데이터를 입력하면 QC, Trimming, assemble부터 위에서 언급한 모든 분석 방법들을 한 번에 처리할 수 있는 파이프라인도 개발되었다. ARGs-OAP나 MEGARes의 경우 Galaxy와 같은 NSG 데이터 통합 분석 플랫폼에 탑재하여 이용할 수 있으며, Qiagen Bioinformatics에서 판매하는 NGS 및 생물정보 데이터 분석 프로그램, CLC Genomics Workbench에도 CLC Microbial Genomics Module이라는 플러그인을 통하여 이용할 수도 있다.

참고 문헌 #

1. Ying Yang, Xiaotao Jiang, Benli Chai, Liping Ma, Bing Li, Anni Zhang, James R. Cole, James M. Tiedje, Tong Zhang; ARGs-OAP: online analysis pipeline for antibiotic resistance genes detection from metagenomic data using an integrated structured ARG-database, Bioinformatics, Volume 32, Issue 15, 1 August 2016, Pages 2346–2351
2. Steven M. Lakin, Chris Dean, Noelle R. Noyes, Adam Dettenwanger, Anne Spencer Ross, Enrique Doster, Pablo Rovira, Zaid Abdo, Kenneth L. Jones, Jaime Ruiz, Keith E. Belk, Paul S. Morley, Christina Boucher; MEGARes: an antimicrobial resistance database for high throughput sequencing, Nucleic Acids Research, Volume 45, Issue D1, 4 January 2017, Pages D574–D580
3. https://galaxyproject.org/public-galaxy-servers/args-oap/
4. https://www.qiagenbioinformatics.com/products/clc-microbial-genomics-module/
5. https://nanoporetech.com/resource-centre/posters/real-time-detection-antibiotic-resistance-genes-using-oxford-nanopore

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